退黃合劑對ANIT致膽汁淤積性肝損傷的保護作用及機制研究*

陳新瑜 李小清 況 舸 陳蓉春 胡文艷 龔 霞 萬敬員△

（1.重慶市中醫院，重慶 400021；2.重慶醫科大學，重慶 400016）

膽汁淤積性肝炎是由于多種原因引起的膽汁分泌或排泄障礙，導致膽紅素增高，最終出現肝細胞變性或壞死。其作為臨床上最常見的肝炎之一，在中醫學中屬于“黃疸”范疇。目前，現代醫學對其無特異性治療手段，而中醫在黃疸的治療方面有其獨特的療效。中醫學認為，濕邪是黃疸最主要的病因，無論陽黃，陰黃的發生均有濕邪內蘊，因此，清熱利濕、疏利肝膽成為退黃的關鍵所在。退黃合劑是根據劉華寶教授經驗方制成的合劑，該合劑由茵陳蒿、大黃、平地木、田基黃、蘇木、瞿麥6味中藥組方，具有清熱利濕、化瘀退黃之功，使濕邪從二便而出，諸藥合用，相須相使，相得益彰，共奏退黃之效而無損脾胃之弊［1］。本實驗擬以ANIT誘導的膽汁淤積性肝損傷為模型，研究退黃合劑對其保護作用，并進一步探討作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級SD大鼠，雌雄各半，體質量180～220 g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號SCXK（渝）20070001。

1.2 藥物與試劑 退黃合劑（規格1 g/mL，產品批號13090902）由重慶市中醫院制劑室提供，異硫氰酸-1-萘酯（ANIT）為上海阿拉丁公司；丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、 天冬氨酸氨基轉移酶 （AST）、 堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、髓過氧化物酶（MPO）和超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒為南京建成生物工程研究所產品；ECL化學發光和BCA蛋白定量試劑盒（美國pierce公司），大鼠巨噬細胞炎性蛋白（MIP）-2 ELISA檢測試劑盒、細胞間黏附分子（ICAM）-1和β-ACTIN抗體（英國Abcam公司）。

1.3 儀器 BIORAD酶標儀（550），BIORAD電流和轉膜儀，722分光光度計算，LEICA石蠟切片機，NIKON顯微鏡（TE-2000）。

1.4 分組與給藥 將動物隨機分成5組，即空白對照組，ANIT模型組，退黃合劑低、中、高劑量組，每組12只。空白對照組給等容積的生理鹽水，ANIT模型組一次性灌胃 150 mg/kg ANIT［2］。退黃合劑低、中、高劑量組，分別給予退黃合劑每日 5、15、30 g/kg，灌胃 3 d，最后1次給藥后30min一次性灌服150 mg/kg ANIT。

1.5 標本采集與檢測 大鼠在ANIT灌胃48 h后處死，分別取血清和肝組織用于指標分析。取大鼠血液，離心（3000 r/min，10min）后取血清，按試劑盒說明書分別檢測血清中 ALT、AST、ALP、DBIL 和 TBIL。取部分肝臟組織，4%多聚甲醛固定后梯度酒精脫水后石蠟包埋、切片、HE染色，光學顯微鏡200倍下觀察肝組織形態變化。取肝組織200 mg用加入蛋白酶抑制劑的組織裂解液提取總蛋白，并測定總蛋白濃度。隨后按ELISA試劑盒說明書測定肝組織中MIP-2含量，以每毫克總蛋白標準化。用上述提取總蛋白按試劑盒說明書檢測SOD活性。另取大鼠肝組織200 mg提取總蛋白，然后檢測肝組織內MPO的活性，并計算每克肝組織中MPO的活性。免疫組織化學法檢測ICAM-1表達，取100 mg肝組織研磨后裂解組織、提取蛋白，BCA法蛋白定量。取40 μg蛋白上樣，SDS-PAGE電泳后，轉移至硝酸纖維素膜上，室溫下封閉1 h；加入一抗4℃冰箱孵育過夜；脫洗3次，二抗孵育1 h，再脫洗5次后，ECL顯色，X光片曝光，洗片。

1.6 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件。計量資料以（）表示，組間比較應用 t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組血清轉氨酶、ALP和膽紅素水平比較 見表1。與空白對照組相比，ANIT模型組血清中ALT、AST和ALP酶的活性明顯增高，同時血清中DBIL、TBIL也顯著增加（P＜0.01）；而相對于ANIT模型組，退黃合劑低、中、高劑量組血清中ALT、AST和ALP活性盡管在低劑量組無顯著差異（P＞0.05），但高、中劑量組顯著降低（P＜0.05或 P＜0.01）。而 ALP、DBIL、TBIL 退黃合劑各劑量組均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），且呈劑量低賴性降低。

表1 各組大鼠血清中ALT、AST、ALP、DBIL和TBIL水平比較（）

表1 各組大鼠血清中ALT、AST、ALP、DBIL和TBIL水平比較（）

與空白對照組比較，*P＜0.01；與ANIT模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

2.2 各組肝臟組織形態學實驗結果 見圖1。空白對照組，肝小葉結構清晰，膽管區無明顯異常，但在ANIT模型組的肝臟中，可見炎性細胞浸潤，肝細胞變性、壞死，膽管上皮細胞結構破壞。退黃合劑可改善ANIT導致的這些病理改變，特別是在高劑量組，可見肝細胞壞死明顯減少，膽管區結構清晰。

圖1 各組肝臟組織形態學（200倍）

2.3 各組肝組織中MIP-2、MPO和SOD水平比較 見表2。與空白對照組比較，ANIT模型組肝內MIP-2生成和MPO活性顯著增高（P＜0.01），但SOD的活性卻明顯降低（P＜0.01）；相對于ANIT模型組，退黃合劑呈劑量依賴地抑制MIP-2生成和MPO的活性，但卻增高SOD的活性。

表2 各組大鼠肝組織中MPO、SOD活性及MIP-2水平比較（）

表2 各組大鼠肝組織中MPO、SOD活性及MIP-2水平比較（）

2.4 各組肝組織中ICAM-1表達的實驗結果 見圖2、表3。以內參蛋白β-actin的表達量標準化后，相對于空白對照組，ANIT模型組動物肝組織中ICAM-1的表達明顯上調（P＜0.01），然而這種上調ICAM-1可被退黃合劑呈劑量依賴地下調。

圖2 各組肝組織中ICAM-1表達水平

表3 各組大鼠肝組織中ICAM-1表達量（）

表3 各組大鼠肝組織中ICAM-1表達量（）

與 ANIT模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白對照組比較，△P＜0.01。

3 討 論

ANIT是一種肝毒性物質，主要影響膽管上皮細胞和肝細胞，導致肝內膽汁淤積性肝損傷，表現為血液中膽紅素和轉氨酶的顯著增高［2］。本研究發現，退黃合劑可呈劑量依賴性地改善ANIT誘導的這種肝損傷，包括減少轉氨酶和ALP的活性，降低血清中DBIL和TBIL的含量，減輕肝臟的病理性改變。因此，退黃合劑對ANIT致膽汁淤積性肝炎有保護作用。

先前的研究表明，中性粒細胞介導的炎癥反應在ANIT致膽汁淤積性肝炎發病中扮演著重要的作用［3］。ANIT損傷膽管細胞和肝細胞，釋放一系列介質，通過募集大量的中性粒細胞，產生活性氧，引起肝臟的炎癥反應，加重膽汁淤積和肝臟的壞死。在本研究中，筆者發現ANIT處理的大鼠肝臟中MPO活性顯著增高，而退黃合劑劑量依賴地抑制MPO的活性。由于MPO是中性粒細胞特異性標志分子，因此，這一結果提示，退黃合劑能有效地減輕肝臟中性粒細胞的浸潤。另外，浸潤的中性粒細胞通過NADPH氧化酶生成大量活性氧，氧化肝臟中的還原酶如SOD等，阻斷這些還原酶的活性。基于此，筆者也分析肝臟中SOD活性，其結果也顯示，退黃合劑明顯改善ANIT抑制的SOD活性。MIP-2被認為是促進中性粒細胞浸潤的最主要趨化因子，可通過和中性粒細胞上的CXCR2受體結合，吸引中性粒細胞的募集。Xu等［4］在研究中發現，ANIT致肝內中性粒細胞浸潤，是通過誘導肝細胞釋放MIP-2實現的，CXCR2敲除的肝臟內中性粒細胞明顯減少，且ANIT誘導的肝損傷也顯著減輕。通過酶聯免疫法進一步檢測肝組織內MIP-2的含量，筆者發現：相似于MPO的結果，退黃合劑也呈劑量依賴性地抑制ANIT誘導的肝內MIP-2的生成。事實上，在炎癥細胞浸潤過程中，除了趨化因子，也涉及到一些黏附分子。ICAM-1是一個重要的黏附分子，能介導重要的炎性細胞如巨噬細胞、中性粒細胞等的浸潤，ICAM-1和Mac-1參與肝臟內中性粒細胞的募集和活化［5］。通過免疫印跡法筆者也發現退黃合劑能抑制ANIT上調的ICAM-1的表達。

總之，通過本研究可以發現，退黃合劑是一種有效的肝臟保護和降低黃疸的中藥方劑，其作用機制可能涉及到通過降低MIP-2的生成和ICAM-1的表達，從而減輕肝臟中性粒細胞引起的炎癥反應。

［1］魏日胞，霍海如，周愛香.退黃合劑主要藥效學研究［J］.中藥藥理與臨床，2001，17（2）：33-34.

［2］Kobayashi M，Higuchi S，Mizuno K， et al.Interleukin-17 is involved in alpha-naphthylisothiocyanate-induced liver injury in mice［J］.Toxicology，2010，275（1-3）：50-57.

［3］Hill DA，Jean PA，Roth RA.Bile duct epithelial cells exposed to alpha-naphthylisothiocyanate produce a factorthat causes neutrophil-dependenthepatocellularinjuryinvitro ［J］.Toxicol Sci，1999，47（1）：118-125.

［4］Xu J，Lee G，Wang H，et al.Limited role for CXC chemokines in the pathogenesis of alpha-naphthylisothiocyanate-induced liver injury［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2004，287（3）：G734-741.

［5］Luyendyk JP，Flanagan KC，Williams CD，et al.Tissue factor contributes to neutrophil CD11b expression in alphanaphthylisothiocyanate-treated mice［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2011，250（3）：256-262.