血府逐瘀湯及桔梗、牛膝對(duì)大鼠不同臟器中環(huán)核苷酸水平的影響*

吳承峰 劉 敏 陳菁菁 唐德才

（1.鐘山職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210049；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023）

目前在血府逐瘀湯的研究中，對(duì)于引經(jīng)藥桔梗、牛膝對(duì)全方效用的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。筆者以慢性氣滯血瘀模型大鼠為載體，在前期研究基礎(chǔ)上［1-2］，采用ELISA法，觀察桔梗、牛膝不同配伍的血府逐瘀湯對(duì)血瘀證模型大鼠各臟器組織中 cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP比值的影響，以期探明桔梗、牛膝的配伍意義及引經(jīng)作用?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)健康成年SD大鼠90只，全雄性，體質(zhì)量（200±20） g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（浙）20080033。其隨機(jī)分為空白組、模型組、全方組、全方無(wú)桔梗組、全方無(wú)牛膝組、全方無(wú)桔梗牛膝組、桔梗牛膝配伍組、桔梗組、牛膝組共9組，每組各10只。

1.2 藥物與試劑 （1）藥物。血府逐瘀湯方中各藥均購(gòu)自南京中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂門(mén)診部并經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定學(xué)教研室鑒定。組成及劑量參照成人（體質(zhì)量 60 kg）的用量比例：桃仁 12 g，紅花 9 g，當(dāng)歸 9 g，生地黃 9 g，川芎 4.5 g，赤芍 6 g，牛膝 9 g，桔梗 4.5 g，柴胡3 g，枳殼6 g，甘草3 g。并由國(guó)醫(yī)堂門(mén)診部提供并進(jìn)行制備煎液及水浴濃縮，每日1劑。鹽酸腎上腺素注射液（天津金耀氨基酸有限公司）；氯化鈉注射液（中國(guó)廣州百特醫(yī)療用品有限公司）。（2）試劑。大鼠環(huán)磷酸腺苷（cAMP）ELISA試劑盒由上海西唐生物科技有限公司提供；大鼠環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷（cGMP）ELISA試劑盒由上海西唐生物科技有限公司提供。

1.3 動(dòng)物模型制備 參考文獻(xiàn)方法［3］，采用連續(xù)多次小劑量皮下注射腎上腺素（0.1%Adr），模擬較長(zhǎng)時(shí)間大怒及情感焦慮狀態(tài)，制備氣滯血瘀動(dòng)物模型。具體操作方法：用0.9%氯化鈉注射液10 mL將0.1%鹽酸腎上腺素注射液稀釋為0.01%鹽酸腎上腺素注射液，注射劑量為0.08 mg/kg體質(zhì)量，頸背部皮下注射，每日1次，連續(xù)7 d?？瞻捉M于相同部位、相同時(shí)間注射等量0.9%氯化鈉注射液。各組動(dòng)物均在最后一次注射鹽酸腎上腺素注射液后24 h處死。

1.4 給藥方法 自造模之日起，各實(shí)驗(yàn)組分別灌胃中藥水煎濃縮液（1 mL/100 g），其中全方組含生藥1.27 g/mL、全方無(wú)桔梗組1.18 g/mL、全方無(wú)牛膝組1.12 g/mL、全方無(wú)桔梗牛膝組1.03 g/mL、桔梗牛膝組0.23 g/mL、牛膝配伍組 0.15 g/mL、桔梗組 0.08 g/mL，每日 1次，連續(xù)7 d。模型組、空白組分別灌胃0.9%氯化鈉注射液1 mL/100 g。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法 上述各組動(dòng)物處死后，立即剖取其心、肺、肝、腎組織，各組織分別取約50 mg。所取組織用生理鹽水沖洗其上之血液或內(nèi)容物，放入盛有2 mL冷醋酸緩沖液（pH值4.75、濃度50 mmol/L）的試管中，立即冰浴勻漿，懸浮液加入無(wú)水乙醇2 mL，混勻，靜置 5min，3500 r/min離心 15min，收集上清液。再用75%乙醇2 mL洗沉淀物，混勻，3500 r/min離心15min。合并上清液，60℃烘箱中烘干。ELISA法測(cè)定各臟器組織中cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP比值，測(cè)定方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以 （）表示，多組主要定量指標(biāo)采用One-Way ANOAY方差分析，兩組間比較采用LSD及S-N-K分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠各臟器組織中cAMP的比較 見(jiàn)表1。（1）心臟組織。與空白組比較，模型組cAMP水平明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組對(duì)cAMP水平均有降低趨勢(shì)，其中以全方組、無(wú)牛膝組明顯（P＜0.05）；其他各組雖有減少，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與全方組比較，桔梗牛膝配伍組降低cAMP水平較弱（P＜0.05）。與牛膝組比較，全方組、全方無(wú)牛組、全方無(wú)桔梗牛膝組均有顯著差異 （P＜0.01），全方無(wú)桔梗組、桔梗組亦有顯著差異（P＜0.05）。（2）肺臟組織。與空白組比較，模型組cAMP水平降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各用藥組之間比較，雖有數(shù)據(jù)上的差異，但是影響無(wú)規(guī)律，且無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（3）肝臟組織。與空白組比較，模型組cAMP水平明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組對(duì)cAMP水平均有降低趨勢(shì)，其中以全方組、全方無(wú)桔組、全方無(wú)桔梗牛膝組作用較明顯（P＜0.01）；牛膝組作用明顯（P＜0.05）；與桔梗牛膝配伍組、桔梗組比較，全方組、全方無(wú)桔梗組有顯著差異（P＜0.01）；全方無(wú)桔梗牛膝組、牛膝組亦有顯著差異（P＜0.05）。與牛膝組比較，桔梗牛膝配伍組、桔梗組有顯著差異（P＜0.05）。（4）腎臟組織。與空白組比較，模型組cAMP水平降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各用藥組之間比較，雖有數(shù)據(jù)上的差異，但是影響無(wú)規(guī)律，且無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 對(duì)大鼠各臟器組織中cAMP的影響結(jié)果（pmol/mL，）

表1 對(duì)大鼠各臟器組織中cAMP的影響結(jié)果（pmol/mL，）

與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與全方組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與無(wú)桔組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01；與桔牛組比較，■P＜0.05，■■P＜0.01；與桔梗組比較，●P＜0.05，●●P＜0.01。與牛膝組比較，※P＜0.05，※※P＜0.01。

2.2 對(duì)大鼠各臟器組織中cGMP的影響 見(jiàn)表2。（1）心臟組織。與空白桔梗牛膝配伍組比較，模型組cGMP水平明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組對(duì)cGMP水平均有明顯降低趨勢(shì)（P＜0.01）。與全方組比較，桔梗牛膝配值組、桔梗組、牛膝組降低cGMP水平較弱。（2）肺臟組織。與空白組比較，模型組cGMP水平明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，全方組對(duì)cGMP水平升高趨勢(shì)最為明顯（P＜0.01）。與全方組比較，全方無(wú)桔梗牛膝組升高cGMP水平較弱（P＜0.05），其他各組升高趨勢(shì)更弱，有顯著差異（P＜0.01）。（3）肝臟組織。與空白組比較，模型組cGMP水平明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組對(duì)cGMP水平均有降低趨勢(shì)，其中桔梗組較明顯（P＜0.05）；其他各組作用均非常明顯（P＜0.01）。（4）腎臟組織。與空白組比較，模型組cGMP水平明顯降低（P＜0.01）。與無(wú)全方牛膝組比較，全方無(wú)桔梗牛膝組、牛膝組水平有明顯差異（P＜0.05）。

表2 對(duì)大鼠各臟器組織中cGMP的影響結(jié)果（pmol/mL，）

表2 對(duì)大鼠各臟器組織中cGMP的影響結(jié)果（pmol/mL，）

與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與全方組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與無(wú)牛組比較，■P＜0.05，■■P＜0.01。

2.3 對(duì)大鼠各臟器組織中cAMP/cGMP比值的影響見(jiàn)表3。（1）心臟組織。與模型組比較，牛膝組對(duì)cAMP/cGMP比值升高趨勢(shì)較明顯（P＜0.01）。與桔梗組比較，牛膝組對(duì)比值升高作用較弱（P＜0.05）。（2）肺臟組織。與空白組比較，模型組比值明顯升高（P＜0.05）。組間比較，全方無(wú)桔梗組與全方無(wú)桔梗牛膝組作用差異明顯（P＜0.05），其中全方無(wú)桔梗組對(duì)模型組比值影響較小，而全方無(wú)桔梗牛膝組則影響較大。（3）肝臟組織。與模型組比較，全方無(wú)牛膝組、桔梗牛膝配伍組對(duì)比值有明顯升高趨勢(shì)（P＜0.05）。（4）腎臟組織。與空白組比較，模型組比值水平明顯降低（P＜0.01）。與牛膝組比較，全方組作用有明顯差異（P＜0.05），全方無(wú)牛膝組作用有極明顯差異（P＜0.01）。

表3 對(duì)大鼠各臟器組織中cAMP/cGMP的影響結(jié)果（pmol/mL，）

與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01； 與全方組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與無(wú)桔組比較，■P＜0.05，■■P＜0.01； 與牛膝組比較，●P＜0.05，●●P＜0.01。

3 結(jié) 論

cAMP、cGMP在體內(nèi)各組織普遍存在，是細(xì)胞功能的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)；cAMP、cGMP對(duì)多種信息，尤其是藥物的刺激非常靈敏，且各組織臟器中的含量水平，基本上可反映其細(xì)胞功能的某一動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，許多中藥均是通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)環(huán)核苷酸含量而起作用；反之，從環(huán)核苷含量變化中亦可觀察到中藥對(duì)機(jī)體的影響以及對(duì)疾病的療效［4-5］。近年來(lái)，不少學(xué)者對(duì)cAMP、cGMP隨“陰陽(yáng)盛衰”而變化的現(xiàn)象作了大量研究，表明它們之間存在著類(lèi)似中醫(yī)陰陽(yáng)學(xué)說(shuō)的相互矛盾及對(duì)立統(tǒng)一的關(guān)系［6］。

本研究表明，血瘀模型組心、肝組織中cAMP、cGMP含量明顯升高，而肺腎組織中cAMP、cGMP含量卻呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，對(duì)cAMP/cGMP比值的影響則正好相反。從各用藥組數(shù)據(jù)分析，含桔梗的用藥組心臟組織中cAMP、cGMP水平明顯降低，而含牛膝的用藥組則降低均不明顯。對(duì)肝臟中cAMP含量的影響卻恰恰相反，即含牛膝的用藥組肝臟組織中cAMP水平明顯降低，而含桔梗的用藥組則降低不明顯。肝臟組織中cGMP的變化，除桔梗組外，其他各組作用均非常明顯，表明桔梗、牛膝確實(shí)能影響心、肝組織中cAMP和cGMP的分布水平，這與桔梗“載藥上行”、牛膝“引藥下行”的引經(jīng)理論正相符合。對(duì)肺、腎組織中cAMP的影響雖有數(shù)據(jù)上的差異，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示可能與血府逐瘀湯主要用于“血府”血瘀證有關(guān)，其部位雖在胸中，但血瘀證主要與心、肝關(guān)系密切。

對(duì)肺臟組織中cGMP的影響，以全方組對(duì)cGMP水平升高影響最為明顯。與全方組比較，無(wú)桔梗牛膝組cGMP水平升高較弱，其他各組升高趨勢(shì)更弱。提示全方組效果最好，而桔梗牛膝配伍則會(huì)影響藥物在肺臟中的分布，說(shuō)明牛膝“引藥下行”之功可能影響桔梗“載藥上行”特性。對(duì)腎臟組織中cGMP的影響，則以牛膝組和無(wú)桔梗組最明顯，無(wú)牛膝組則作用最弱，提示牛膝確能增加cGMP在腎臟中的分布，通過(guò)觀察對(duì)各臟器組織中cAMP/cGMP比值的影響，也發(fā)現(xiàn)有此規(guī)律。

綜上，研究證實(shí)桔梗確有“載藥上行”之功，能增加藥物在心肺中的分布；而牛膝確有“引藥下行”之力，能增加藥物在肝腎中的分布；桔梗與牛膝單獨(dú)使用，或單獨(dú)配伍多起拮抗作用，但在全方中配伍卻起協(xié)同作用，這也正是中醫(yī)組方精妙之所在。

［1］陳菁菁，劉敏，唐德才.血府逐瘀湯及桔梗、牛膝配伍對(duì)血清NO、血漿ET-1的影響［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，13（11）：123-124.

［2］劉敏，唐德才，陳菁菁.血府逐瘀湯及方中桔梗、牛膝對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)的影響［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，14（1）：76-78.

［3］和嵐，蔣文躍，毛騰敏.注射腎上腺素模擬“氣滯”復(fù)制急、慢性血瘀模型初探［J］.中國(guó)中西醫(yī)藥結(jié)合雜志，2004，24（3）：244-246.

［4］王樹(shù)榮，翟繼偉，蓋英臣，等.天麻、桔梗、元胡歸經(jīng)的實(shí)驗(yàn)研究［J］.上海中醫(yī)藥雜志，1995，41（1）：44-46.

［5］王樹(shù)榮，孫冰，丁國(guó)明.中藥歸經(jīng)的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)中藥雜志，1994，19（8）：500-502.

［6］王淑美，徐曉玉.滋陰清熱藥對(duì)環(huán)核苷酸的影響［J］.藥學(xué)專論，2003，12（7）：26-27.