針刺干預實驗性腦出血大鼠細胞凋亡的時效研究

劉學文 周 競 彭 平 張宏生 李 平 荊志偉

（1.首都醫科大學潞河教學醫院，北京 101100；2.北方工業大學醫院，北京 100041；3.中國中醫科學院望京醫院，北京 100102；4.北京中醫藥大學，北京 100029；5.天津市第三中心醫院，天津 300170；6.中國中醫科學院，北京 100700）

腦出血是指原發性非外傷性腦實質內出血，是急性腦血管疾病中的危重類型，發病率、死亡率及致殘率均較高，嚴重危害人類健康及生活質量［1］，目前神經內、外科治療效果并不令人滿意［2］，腦出血早期是治療的關鍵［3］。中醫藥包括針灸療法在腦出血急性期治療中得到廣泛應用，已成為整個治療體系中重要的一部分［4-6］。但在腦出血發病后不同時期給予針刺療效是否相同，針刺介入時機是否越早越好，是需要解決的問題。本研究通過觀察不同時機介入針刺對細胞凋亡因子Bcl-2/Bax及HSP70的表達的影響，研究針刺治療腦出血時機和療效關系及其機理，以期為臨床提供可靠的理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 健康Wistar大鼠（北京醫科大學實驗動物中心提供），體質量250～320 g，雄性。隨機分為空白組、模型組及按針刺介入時間分為的3 h針刺組、9 h針刺組、24 h針刺組、48 h針刺組，每組10只。

1.2 儀器與試藥 腦立體定向儀（日本SR-6N）；微量注射器（上海激光醫學儀器廠）；渦輪牙鉆機（北京自動化儀表三廠）；電子天平（日本ANDHR-120，精確度為0.1 mg）；恒溫干燥箱（北京市朝陽區來廣營醫療器械廠）；CMIS型細胞醫學圖像分析系統（重慶天海）；石蠟切片機 （德國LEICA RM 2135）；OLYMPUS光學顯微鏡（日本）；天平（常熟市衡器廠HR-120）；手術器械。

磷酸鹽緩沖試劑（0.1 mol/L PBS 液，pH 7.2～7.4）：用氯化鈉9g，12水磷酸氫二鈉6 g，水磷酸二氫鈉0.4g，加蒸餾水至1000 mL，調整pH到7.2～7.4。枸櫞酸鹽緩沖液（0.01 mol/L）：枸櫞酸三鈉 3 g，枸櫞酸 0.4 g，加蒸餾水至1000 mL。防脫片劑：APES購自北京中山生物技術有限公司。甲苯、丙酮、無水乙醇、30%過氧乙酸，均為上海試劑一廠產品。蘇木素、伊紅為北京試劑三廠產品。即用型SABC免疫組織化學染色試劑盒、DAB顯色試劑盒、一抗均為武漢博士德生物工程有限公司產品。TUNEL盒購于博海生物技術有限公司。

1.3 模型制備 以10%水合氯醛（300 mg/kg體質量）腹腔麻醉后俯臥位固定于立體定向儀上。固定大鼠時，先固定耳間線，待聽到水平針穿破耳鼓膜的破裂聲后，移頭部至正中，接著固定門齒于門齒鉤上，調整立體定向儀，使門齒鉤平面比耳間線平面低2.4 mm，此時前后囟基本上在同一平面上。頭部正中皮膚切開長約1 cm的縱切口，血管鉗鈍性分離暴露前囟，調整立體定向儀，使其上的微量注射儀套管尖端移至前囟后0.5 mm，左側中線旁開3 mm，用微型電鉆鉆孔，穿透顱骨但不傷及腦組織。用40℃水溫浴大鼠尾巴約10min后取出擦干，在距離大鼠尾巴末端約5 mm處剪斷鼠尾，用微量注射儀吸取新鮮血液約50 μL，迅速插入已鉆好的孔內，向內進針6 mm（相當于尾狀核部位）。在2min內勻速注入10 μL血液，停針2min，再在2min內勻速注入40 μL血液，留置4min后，將針頭提升2 mm，再留置8min，然后緩慢將微量注射器針頭拔出，用醫用骨蠟封閉骨孔。觀察無出血后，縫合頭部皮膚，加壓包扎尾部切口。

1.4 神經功能缺損評價 術后1 h左右，造模大鼠清醒后即開始進行大鼠神經功能缺損評價，根據Bederson神經體征評分法［7］進行分級。輕抓鼠尾，提起高于桌面10 cm，正常大鼠前爪伸直。0級（0分）：無神經功能缺損。1級（1分）：血腫對側前肢回收屈曲于腹下，同側前肢向地面伸展。2級（2分）：1級體征加俯臥于桌面時從血腫側向對側推大鼠時阻力降低。3級（3分）：1級體征加2級體征加大鼠行走向血腫對側肢體旋轉 （呈追尾狀）。4級（4分）：意識喪失不能行走。

1.5 針刺穴位與方法 大鼠腧穴定位根據《動物針灸穴位圖譜》，針刺組選取內關、人中針刺，內關用捻轉瀉法1min，人中用雀啄手法10次。各針刺組分別于造模成功后相應時間開始針刺，3 h針刺組在造模成功后3 h開始介入針刺，9 h針刺組在造模成功后9 h開始介入針刺，24 h針刺組在造模成功后24 h開始介入針刺，48 h針刺組在造模成功后48 h開始介入針刺，均每日針刺2次，連續針刺3 d。

1.6 標本采集與檢測 模型組與針刺組均于造模成功后5 d處死，用斷頭器將大鼠斷頭處死，小心剝離顱骨，取出完整腦組織，以左側大腦半球中部注射針眼處為中點，冠狀位切割腦組織，層厚約2 mm，用于免疫組化，在注射針眼處后4 mm的層厚約1 mm的組織用于腦含水量測定。將應用免疫組化方法的組織固定在4%多聚甲醛中24 h，標本依次梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋，在石蠟切片機上連續切片，片厚5 μm，相鄰切片分別作免疫組化和TUNEL染色，相關方法按照試劑盒說明。

1.7 判斷標準 （1）免疫組化結果判斷標準。以細胞胞漿或細胞核出現黃色顆粒為陽性，對每張玻片取5個高倍視野，計數5個高倍視野內陽性細胞總數，然后計算每個高倍視野下陽性細胞的均數。（2）TUNEL染色結果判斷標準。高倍鏡下可見TUNEL陽性細胞大部分為核呈棕黃色或棕褐色，標記細胞核有明顯固縮、碎裂，少量為彌漫性淡染的核。前者是要計數的凋亡細胞。每張切片光鏡下（×400）分別隨機計算5個視野的陽性細胞數，以平均值代表計數結果。

1.8 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件。各項檢測結果以（）記錄，兩組間比較用t檢驗，多組間用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組動物Bcl-2在血腫周圍的表達情況 見表1。各針刺組分別與模型組相比差異有統計學意義（P＜0.01）；3 h針刺組與9 h針刺組相比差異無統計學意義（P＞0.05）；其余各針刺組之間相比差異有統計學意義（P＜0.01或0.05）。正常組大鼠腦組織中Bcl-2蛋白的表達水平較低，僅見少數該細胞胞漿著色；模型組大鼠腦血腫周圍腦組織表達水平明顯增高，胞漿著色且著色較深。針刺組各組血腫周圍也有不同程度的表達，按表達水平從高到低依次為3 h針刺組、9 h針刺組、24 h針刺組、48 h針刺組。

表1 各組Bcl-2表達水平比較（）

表1 各組Bcl-2表達水平比較（）

與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與 3 h 針刺組比較，**P＜0.05；與9 h 針刺組比較，☆P＜0.05，☆☆P＜0.01；與 24 h 針刺組比較，●P＜0.05，●●P＜0.01。下同。

2.2 各組動物Bax在血腫周圍的表達情況 見表2。各針刺組分別與模型組相比差異有統計學意義 （P＜0.05或0.01）；3 h針刺組與9 h針刺組相比差異無統計學意義（P＞0.05）；其余各針刺組之間相比差異有統計學意義（P＜0.05或0.01）。正常組大鼠腦組織中Bax蛋白的表達水平較低，僅見少數該細胞胞漿著色；模型組大鼠腦血腫周圍腦組織表達水平明顯增高，胞漿著色且著色較深。針刺組各組血腫周圍也有不同程度的表達，按表達水平從低到高依次為3 h針刺組、9 h針刺組、24 h針刺組、48 h針刺組。

表2 各組Bax表達水平比較（）

表2 各組Bax表達水平比較（）

組 別 n空白組 10模型組 103 h針刺組 10陽性細胞數4.27±1.3123.03±2.8115.33±1.94△△9 h 針刺組 10 15.96±1.84△△24 h 針刺組 10 18.21±1.84△△**☆48 h 針刺組 10 20.58±2.46△**☆☆●

2.3 各組動物HSP70在血腫周圍的表達情況 見表3。各針刺組分別與模型組相比差異有統計學意義（P＜0.01）；3 h針刺組與9 h針刺組相比差異無統計學意義（P＞0.05）；其余各針刺組之間相比差異有統計學意義（P＜0.01）。正常組大鼠腦組織中HSP70蛋白的表達水平較低，僅見少數該細胞胞漿著色；模型組大鼠腦血腫周圍腦組織表達水平明顯增高，胞漿著色且著色較深。針刺組各組血腫周圍也有不同程度的表達，按表達水平從高到低依次為3 h針刺組、9 h針刺組、24 h針刺組、48 h針刺組。

2.4 各組動物凋亡細胞在血腫周圍的表達情況 見表4。各針刺組分別與模型組差異有統計學意義 （P＜0.01）；3 h針刺組與9 h針刺組差異無統計學意義（P＞0.05）；其余各針刺組之間差異有統計學意義（P＜0.01或0.05）。正常組大鼠腦組織中各視野偶見TUNEL陽性細胞。模型組大鼠腦血腫周圍腦組織表達水平明顯增高，胞漿著色且著色較深。針刺組各組血腫周圍腦組織也有不同程度的表達，按表達水平從低到高依次為3 h針刺組、9 h針刺組、24 h針刺組、48 h針刺組。

表3 各組HSP70表達水平比較（）

表3 各組HSP70表達水平比較（）

表4 各組凋亡細胞表達水平比較（）

表4 各組凋亡細胞表達水平比較（）

3 討 論

本研究采用立體定向技術向大鼠左側腦基底節注入自體定量不凝血制作腦出血模型［8］。基底節是大鼠腦內最大的核團，易于立體定向，也是人類腦出血好發部位。注入自體不凝血50μL，相當于人類腦出血40mL，為臨床最多見出血量。本研究采用兩次注血兩次退針法，可有效地避免自體血從穿刺針孔處溢出及腦室反流。

腦出血后多種因素導致細胞凋亡，細胞凋亡參與腦出血后某些神經細胞損傷［9-12］，典型的凋亡細胞在形態學上表現為最終形成由細胞膜包裹、含有多少不等核碎片及細胞質的小體，稱之為凋亡小體（apoptosis body），吞噬細胞快速吞噬凋亡小體。大鼠自體血腦出血后血腫周圍腦組織有Bcl-2/Bax、HSP70表達及細胞凋亡，Bcl-2/Bax和HSP70在腦出血后神經細胞凋亡過程中起重要調控作用。Bcl-2是一種凋亡抑制基因，Bax是一種促抑制基因，通過作用于線粒體而誘導細胞凋亡的發生，Bcl-2過度表達可有效地抑制神經元凋亡，但Bax的作用卻相反，且將死的神經元Bax表達增加，Bcl-2則減少，故Bcl-2/Bax的比率可能決定神經元存亡［13-16］。HSP70是一種應激保護蛋白，可通過抑制細胞因子炎癥反應，抑制凋亡激活基因Bax表達，與抑凋亡基因Bcl-2協同作用，保護線粒體功能等發揮抑制凋亡的的作用［17-20］。

中醫的預防醫學概念主要包括兩方面：未病先防，既病防變。任何疾病都有一定的傳變規律和發展趨勢，中醫十分重視掌握病能病勢，主張在疾病未發生或剛發生時就及時截斷其惡性發展的趨勢［21-22］。腦損傷后中樞神經系統在結構上和功能上能夠進行重組和代償，部分神經可以再生，這是大腦可塑性的生理、生化或形態學改變的基礎［23-24］。針刺可加速腦組織的側支循環建立，促進病灶周圍組織或健側腦細胞的重組或代償，更大地發揮腦的可塑性［25-26］。細胞凋亡是腦出血血腫周邊腦組織損傷的主要病理生理機制之一，主要發生在血腫周圍的缺血半暗帶區。在腦出血早期及時有效地治療血腫周圍的半暗帶區，可抑制細胞凋亡，提高神經功能的恢復程度。否則，當細胞損害進入不可逆階段，即病理損害過程已形成后，就失去了治療的最佳時機。

總之，本研究表明，從出血后3 h到出血后48 h各時間點介入針刺，均可抑制腦組織的細胞凋亡，但介入時間越早，對促凋亡因子Bax陽性表達細胞數降低越顯著，對抑凋亡因子Bcl-2及HSP70陽性表達細胞數增加越顯著，對腦組織病理變化改善越明顯，提示干預時機越早，細胞凋亡損傷越小。針刺治療腦出血大鼠腦組織損傷，介入時間越早效果越好，在出血后3～9 h進行針刺干預是最佳時機，48 h內治療仍有意義，可通過抑制細胞凋亡減輕腦組織的繼發性損傷。

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