衰變加速因子在神經病理性疼痛中的作用

朱海娟，王金保

(解放軍白求恩國際和平醫院，河北石家莊050082)

前期研究證實神經病理性疼痛(CNPP)大鼠脊髓背角發生補體異?；罨?，并且證實此處活化的補體蛋白在模型動物痛覺過敏的形成和發展中發揮重要作用［1］。那么，衰變加速因子(DAF，CD55)作為重要的補體調節蛋白，它在NPP的發病過程中是否發揮作用呢?本研究制作2種NPP大鼠模型(CCI、SNI)，采用熱刺激和機械刺激兩種手段評估模型的可靠性后，于建立模型第7天，采用Western－blot和免疫組織化學染色兩種技術測定大鼠脊髓中的DAF蛋白表達變化，旨在為NPP大鼠脊髓背角補體激活尋找“激發點”。

1 實驗資料

1.1 實驗動物及分組 成年健康SD大鼠，雄性，體質量200～250 g，河北醫科大學動物實驗中心提供。每4只飼養于一籠中，籠底鋪有鋸末，室溫(20±2)℃，嚴格12 h明暗交替光照，給予充足的水源和飼料。適應環境1周后進行實驗。所有實驗均在白天進行，大鼠的使用和喂養嚴格遵照河北醫科大學倫理委員會和動物保護協會所規定的有關條款。60只大鼠隨機分為假手術組(A組)、CCI組(B組)及SNI組(C組)3組，每組20只。按照分組進行處理后，分別在術前(t0)、術后1 d(t1)、術后3 d(t2)和術后7 d(t3)進行痛閾值測定，于術后7 d處死大鼠取L4—6段脊髓背角，測定CD55蛋白含量。

1.2 主要儀器和試劑 儀器:RTY－1型熱痛刺激儀，第四軍醫大學生理教研室研制;BME－403型Von frey機械刺激儀，中國醫學科學院生物工程研究所提供;BB16uv型CO2恒溫培養箱，德國Heraeus公司生產;恒溫搖床，重慶醫用器材廠生產;Gel Doc2000凝膠成像分析系統，美國Bio－Rad公司生產。試劑:兔抗大鼠CD55多克隆抗體(CD55(H－319)，批號:sc－9156)，美國Santa Cruz公司生產;辣根酶標記的山羊抗兔IgG(H+L)親和純化二抗，購自北京中山生物技術有限公司。

1.3 CCI、SNI模型的制作 參考文獻［2］制作CCI和SNI模型。CCI模型:大鼠俯臥位捆綁，從后肢上部切開皮膚，分離肌肉，暴露坐骨神經主干，使用羊腸線環繞坐骨神經，單結固定，環繞的羊腸線應能夠在坐骨神經主干上滑動。SNI模型:于大鼠后肢上緣切開皮膚，分離肌肉，暴露坐骨神經主干及其下的分支—脛神經、腓總神經和腓腸神經，結扎并剪斷脛神經和腓總神經，保留細小的腓腸神經，應避免任何損傷。

1.4 行為學測定

1.4.1 熱痛閾測定 用RYT－1型熱痛刺激儀測大鼠熱縮足潛伏期(PWTL)。按 Hargeaves等［3］方法，于 8:00—12:00測定，先將大鼠在熱刺激儀的玻璃操作臺上適應5 min，調節光強度，單次照射時間不超過30 s，以免造成熱輻射損傷，每肢照射3次，取其平均值。為避免或減少1次刺激對隨后刺激效應造成的影響，同一部位刺激的間隔時間為5 min。

1.4.2 機械痛閾測定 參照Dixon［4］的方法:將大鼠置于升高的金屬網上，并蓋以透明的有機玻璃罩，適應20 min，用不同壓力的纖維絲(從小到大)垂直刺激其足底2，3跖趾間皮膚敏感處，逐漸加壓使之成為S形持續6～8 s，觀察是否出現縮足反應，大鼠在刺激時間內或在移開von frey纖維時立即出現快速的縮足反應，記為陽性反應，而身體活動所引起的縮足反應不記作陽性反應。每次間隔5 s，連續10次，誘發4～6次縮足反應作為50%反應率，其壓力值即為閾值。

1.5 免疫組織化學染色 采用SP法對大鼠脊髓標本進行免疫組化染色。腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后，經左心室灌注200 mL生理鹽水和300 mL 4%多聚甲醛溶液，充分固定后，縱向剖開椎管，取脊髓L4—6階段組織，固定24 h，經脫水、透明、浸蠟包埋后，切片機連續切片厚度為4 μm。石蠟切片經二甲苯透明，常規梯度乙醇脫蠟，浸入0.01 mol/L，pH 6.0枸櫞酸鹽溶液中，加熱至98℃后進行抗原修復，30 min后冷卻至室溫，3%H2O2去離子水室溫孵育20 min，正常兔血清封閉液室溫孵育20 min。滴加一抗(兔抗大鼠CD55多克隆抗體)4℃孵育過夜，同時用PBS代替一抗作為陰性對照。PBS液充分洗滌后，加入二抗(辣根酶標記兔抗山羊IgG)37℃孵育30 min。DAB顯色，蘇木精復染，透明、封片。在OLYPUS顯微鏡下觀察，胞膜和胞質中有棕黃色顆粒者為陽性細胞。

1.6 Western－blot檢測 于術后7 d處死大鼠取L4—6段脊髓背角，采用Western－blot技術測定CD55蛋白含量。取每樣40 μg蛋白樣品按常規方法完成8%(w/v)SDS－PAGE電泳，將含有目的蛋白和內標actin的凝膠切割，并經半干法電轉移至聚偏(二)氟乙烯(PVDF)膜上。印跡膜片用5%脫脂奶粉封閉1 h，大膜片加入抗大鼠CD55單克隆抗體，小膜片加入羊抗actin抗體，4℃過夜。用 Tris/0.05%吐溫 －20(TBST)洗膜(5 min×3)，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗(山羊抗鼠IgG)，37℃孵育1 h，TBST充分洗膜(5 min×3)，TBS洗膜10 min。最后印跡膜片與強化學發光試劑ECL溫浴1 min，X線膠片曝光30～60 s，經顯影和定影顯示特異的蛋白信號。大膜片經膜再生液再生(37℃孵育30 min)后孵育鼠抗NR2B抗體，程序同前。信號條帶掃描后，用Quantity one 4.5.0圖像分析軟件進行定量分析。

2 結 果

2.1 各組大鼠痛閾值情況 與術前相比，術后1 d 3組大鼠PWTL和PWMT都有所降低，但B組、C組較A組更明顯(P＜0.05)。術后3，7 d CCI組SNI組大鼠痛閾值持續降低，而A組大鼠痛閾值逐漸恢復到術前水平。見表1。

2.2 脊髓背角免疫組織化學染色結果 A組脊髓背角陽性細胞明顯多于B組和C組，B組和C組相比無顯著性差異。見圖1～3。

表1 各組大鼠痛閾比較(±s)

表1 各組大鼠痛閾比較(±s)

注:①與 t0相比，P ＜0.05;②與 A 組相比，P ＜0.05。

組別 n PWT/s t0 t1 t2 t 3 PWM/g t0 t1 t2 t 3 A 組 20 17.3 ±2.5 13.7 ±1.7① 16.6 ±2.3 16.8 ±2.2 14.2 ±1.9 9.5 ±3.1①13.8 ±2.8 13.7 ±2.5 B 組 20 17.5 ±1.9 12.8 ±3.2① 11.6 ±2.1①② 11.9 ±3.0①② 14.8 ±3.2 7.6 ±1.9① 8.8 ±2.5①② 8.2 ±1.4①②C 組 20 17.7 ±2.9 14.0 ±2.2① 12.8 ±1.8①② 13.4 ±3.5①② 13.9 ±2.0 7.8 ±1.5① 7.4 ±2.2①② 7.8 ±1.7①②

2.3 3組Western－blot實驗結果 采用Western－blot技術檢測了3組大鼠脊髓背角CD55的表達情況。用Quantity one 4.5.0圖像分析軟件分析，β－actin條帶的積光分密度(IOD)一致，反映了總蛋白上樣量一致，B組、C組大鼠脊髓背角CD55表達量較A組顯著降低。見圖4。

3 討 論

衰變加速因子是一種補體調節蛋白，可制止補體級聯反應，保護自身細胞免受傷害。近來研究表明，DAF通過表達的改變，逃避機體免疫監視，在腫瘤形成中發揮重要作用［5－6］。那么，在NPP形成過程中脊髓背角發生異常的補體活化，許多補體蛋白表達發生改變，DAF的表達是否發生變化?它的表達改變在NPP的發生發展中發揮什么樣的作用呢?

圖1 A組大鼠脊髓背角CD55陽性細胞表達情況

圖2 B組大鼠脊髓背角CD55陽性細胞表達情況

圖3 C組大鼠脊髓背角CD55陽性細胞表達情況

圖4 不同處理組大鼠脊髓背角CD55蛋白的表達情況

本研究建立了2種NPP模型，采用測定大鼠痛閾值可靠技術－冷刺激方法和機械刺激方法評估動物模型的穩定性后，于術后第7天處死大鼠，采用免疫組織化學技術和免疫印跡技術2種手段對模型大鼠脊髓中的CD55進行檢測。結果顯示，2種不同外周神經損傷模型脊髓中CD55在建模后表達發生了不同程度的降低，與假手術組比較有顯著性差異。這個結果與筆者前期研究NPP時脊髓背角發生級聯反應是一致的［1］。那么，CD55是如何在NPP的形成中發揮作用的呢?外周神經損傷時，脊髓背角膠質細胞活化，表達補體蛋白量增加，進而觸發級聯反應［7］。正常情況下，由于細胞膜上表達的CD55分子可干擾C3轉化酶和C5轉化酶，以致不能形成膜攻擊復合，補體級聯反應被阻斷，保護自身細胞免受補體的活化和攻擊。當CD55缺乏或表達下調時，補體級聯反應得以實現，膜攻擊復合物大量形成。此處的神經元不斷遭受補體蛋白的攻擊，內部結構發生改變，從而將傷害性信號上傳中樞，經過中樞的信息分析和整合，表現為痛覺過敏和異常疼痛。因此，可以推測，NPP模型大鼠脊髓中CD55的表達下降可能是此處發生補體異?；罨脑颍辽偈怯|發因素之一。

關于CD55在NPP中的研究目前還比較少，本研究只是為探索NPP發病機制提供一個思路。相信隨著研究的深入，NPP必將為人類所攻克。

［1］王金保，王琪，聶發傳，等.脊髓補體C3蛋白在大鼠神經病理性痛維持中的作用［J］.中華麻醉學雜志，2008，28(1):49－52

［2］金小高，羅愛林，王金韜，等.脊髓神經元和膠質細胞激活在三種神經病理性疼痛大鼠模型脊髓水平致痛機制的作用［J］.中華麻醉學雜志，2006，26(1):71 －74

［3］Hargeaves K，Dubner R，Brown F，et al.A new and sensitive method for mearing thermal nociception in cutaneous hyperalgesia［J］.Pain，1988，32(1):77 －78

［4］Dixon WJ.Efficient analysis of experimental observation［J］.Ann Rev Pharmacol Toxicol，1980，20:441 －462

［5］張海譜，單保恩，艾軍，等.ALDHI和CD55表達在乳腺癌預后評估中的意義［J］.解放軍醫學雜志，2010，35(1):20－23

［6］王芹，張玲，張維東，等.胃癌組織衰變加速因子表達及其臨床意義的研究［J］.中華腫瘤防治雜志，2008，15(9):683－686

［7］Robert SG，Michael C，Gary JB，et al.Complement induction in spinal cord microglia results in anaphylatoxin C5 a－Mediated pain hypersensitivity［J］.J Neurosci，2007，27(32):8699 － 8708