頂空氣相色譜法同時測定燈盞花乙素中5種有機溶劑殘留量

王 相，張 偉，董知旭 ，楊兆祥△

（1.昆明醫(yī)科大學，云南昆明 650500；2.昆明制藥集團股份有限公司，云南昆明 650100）

燈盞花乙素是從燈盞細辛中提取的黃酮類有效成分，結(jié)構(gòu)式鑒定為4，5，6-三羥基黃酮-7-葡萄糖醛酸甙，又名野黃芩苷（以下用SCU表示）（見圖1）。目前已經(jīng)有人工合成燈盞花乙素的研究[1]。人工合成燈盞花乙素過程中使用了甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、DMF等有機溶劑，此5種溶劑均為限制使用的溶劑，必須對其殘留量進行考察[2]。因此制定本方法以控制燈盞花乙素中甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、DMF的殘留量。

圖1 燈盞花乙素結(jié)構(gòu)式

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Clarus-600氣相色譜儀（美國Perkin Elmer），F(xiàn)ID 檢測器，DB-1301（30m×0.32mm×1.0μm）毛細管色譜柱，Turbomartrix 40頂空進樣器（美國Perkin Elmer），BP221-S 型電子天平（Sartorius）

1.2 試藥

燈盞花乙素（SCU）由昆明制藥集團股份有限公司提供，批號分別為 20121026，20121029，20121030。DMA、甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、DMF均為色譜純。

2 色譜條件[3-4]

2.1 溶解介質(zhì)的選擇

由于SCU在堿性水溶液中的溶解性極差，且殘留溶劑DMF的沸點為152.3℃，考慮若采用堿性水溶液或水為溶解介質(zhì)，不僅不能滿足SCU的溶解性要求，而且會影響頂空溫度的選擇，故決定使用有機溶劑為溶解介質(zhì)。

氣相色譜法常用的有機溶解介質(zhì)有DMA、DMF等，由于殘留溶劑有DMF，故選擇DMA為溶解介質(zhì)。

2.2 頂空時間、溫度的選擇

2.2.1 混合對照品溶液

精密稱取甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、DMF適量，用DMA稀釋成1mL含甲醇0.3mg、乙醇0.5mg、丙酮0.5mg、二氯甲烷0.06mg、DMF0.088mg的混合溶液，即得。

2.2.2 頂空時間的選擇

分別設(shè)置頂空時間為20，25，30，35，40，45，50min，進樣混合對照溶液，結(jié)果見表1，由表可知30min時，甲醇、乙醇、二氯甲烷、DMF均達到氣液平衡，且丙酮的峰面積達到檢測要求，故選擇頂空時間為30min。

表1 頂空時間選擇結(jié)果數(shù)據(jù)表

2.2.3 頂空溫度的選擇

分別設(shè)置頂空溫度為 70，75，80，85，90，95℃，進樣2.2.1項下的混合對照溶液，結(jié)果見表2。可見隨著溫度的升高殘留溶劑的峰面積均增大，綜合考慮高溫下樣品的穩(wěn)定性及檢測的要求，最終確定頂空溫度為90℃。

表2 頂空溫度選擇結(jié)果數(shù)據(jù)表

2.3 色譜條件的確定

載氣為N2，采用線速率模式，流速1.0mL/min；分流比 1∶1；柱溫采用程序升溫，初始柱溫：60℃，保持6min，以70℃/min的速度升溫到160℃，保持10min；進樣口溫度：200℃；氫火焰檢測器溫度：220℃；頂空溫度90℃，進樣針溫度100℃，傳輸線溫度100℃；頂空保溫時間30min。

3 實驗內(nèi)容

3.1 專屬性考察

3.1.1 空白溶液

量取DMA5.0mL于10mL頂空瓶，加蓋密封，即得。

3.1.2 對照溶液

量取DMA5.0mL于10mL頂空瓶，平行6份，記號為1-6號。其中1號瓶中加1滴甲醇，2號瓶中加1滴乙醇，3號瓶中加1滴丙酮，4號瓶中加1滴二氯甲烷，5號瓶中加1滴DMF，6號瓶中甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、DMF各加一滴，加蓋密封，振搖混勻，即得。其中1-5號為單一對照，6號為混合對照。

3.1.3 供試品溶液

精密稱取1.0g的SCU于10mL容量瓶中，加DMA溶解并定容，即得。

3.1.4 專屬性考察

在2.2.4色譜條件下，分別進樣空白溶液、對照溶液、供試品溶液，記錄色譜圖（見圖2-A，2-B，2-C）。結(jié)果在甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、DMF出峰的保留時間處，在空白和供試品溶液中均無干擾峰出現(xiàn)，且5種殘留溶劑彼此之間及與DMA之間互不干擾，分離度均大于1.5，表明專屬性良好。

3.2 精密度考察

3.2.1 混合對照品溶液

精密稱取甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、DMF適量，用DMA稀釋成1mL含甲醇0.3mg、乙醇0.5mg、丙酮0.5mg、二氯甲烷0.06mg、DMF0.088mg的混合溶液，即得。

3.2.2 精密度考察

精密量取3.2.1項下的混合對照品溶液5.0mL于10mL頂空瓶中，平行6份，密封瓶口，頂空進樣，測得甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、DMF峰面積的RSD分別為0.89%，0.51%，0.80%，0.70%，1.81%，表明儀器精密度良好。

3.3 重復(fù)性考察

圖2 空白溶液（A）、對照品溶液（B）、供試品溶液（C）氣相色譜圖

按照3.2.1項下方法平行配置混合對照品溶液6份，每份精密量取5.0mL，分別置于6個10mL頂空瓶中，密封瓶口，頂空進樣，結(jié)果甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、DMF峰面積的RSD分別為0.73%、0.77%、0.50%、0.87%、2.27%.結(jié)果表明方法的重復(fù)性良好。

3.4 最低檢測限和最低定量限

3.4.1 單一對照品溶液

精密稱取甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、DMF適量，分別置于5個頂空瓶中，用DMA稀釋成1mL含甲醇0.3mg、乙醇0.5mg、丙酮0.5mg、二氯甲烷0.06mg、DMF0.088mg的對照品溶液，即得。

3.4.2 最低檢測限和最低定量限的測定

取3.4.1項下的單一對照品溶液，逐步稀釋，精密量取5.0mL于10mL頂空瓶中，立即密封，頂空進樣，記錄色譜圖，計算主峰信噪比，測得甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、DMF的最低檢測限和最低定量限見下表（表 3）。

表3 5種殘留溶劑最低定量限和最低檢測限的測定結(jié)果（單位：μg/mL）

3.5 線性范圍考察

3.5.1 對照品儲備液的制備

精密量取甲醇60mg、乙醇100mg、丙酮100mg、二氯甲烷12mg、DMF17.6mg于100mL容量瓶中，DMA稀釋、定容作為對照品儲備液。

3.5.2 標準曲線的繪制

精密量取對照品儲備液適量，用DMA稀釋成一系列對照品溶液，使甲醇的濃度在0.003~0.450mg/mL，乙醇濃度在 0.005~0.750mg/mL，丙酮濃度在0.005~0.750mg/mL，二氯甲烷濃度在0.0006~0.0900mg/mL，DMF濃度在0.0086~0.1320mg/mL。每個對照品溶液精密量取5mL置于10mL頂空瓶中，在“2.3”項色譜條件下進樣，記錄色譜圖，以濃度為橫坐標，對照峰面積為縱坐標進行線性回歸，回歸方程和線性范圍見表4。

表4 回歸方程及線性范圍

3.6 回收率考察

3.6.1 80%、100%、120%對照品溶液的配制

精密量取3.5.1項下的對照品儲備液10mL、50mL、15mL，分別置于 25mL、100mL、25mL 的容量瓶中，DMA稀釋定容，即得。

3.6.2 回收率測定

精密量稱取燈盞花乙素（批號：20121030）250mg于頂空瓶中，平行12分，記為1-12號，其中1-3號精密加入空白DMA5mL，4-6號精密加入80%對照品溶液5mL，7-9號精密加入100%對照品溶液5mL，10-12號精密加入 120%對照品溶液5mL，加蓋密封，進樣，測定回收率。結(jié)果甲醇的平均回收率為100.89%，RSD為1.16%；乙醇的平均回收率為102.68%，RSD為1.33%；丙酮的平均回收率為103.22%，RSD為1.75%；二氯甲烷的平均回收率為100.75%，RSD為 0.84%，DMF的平均回收率為99.15%，RSD為3.40%.

3.7 穩(wěn)定性考察

精密量取燈盞花乙素適量，用DMA溶解稀釋成濃度為100mg/mL的供試品溶液，取3.6.1項下的100%對照品溶液作為對照品溶液，分別在0，2，4，8，12，16h 時進樣，記錄色譜圖，結(jié)果對照品溶液中甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、DMF的RSD分別為 1.34%、2.23%、0.74%、1.31%、4.72%；樣品溶液中甲醇、乙醇、丙酮的RSD分別為2.91%、1.87%、0.95%（樣品中無二氯甲烷和DMF）。說明樣品及對照的穩(wěn)定性良好。

3.8 樣品測定

精密量取3批SCU樣品，各約1.0g，加DMA溶解并定容至10mL容量瓶中，精密量取5mL于頂空進樣小瓶中，按2.3項下的色譜條件進行測定，同時測定混合對照，按外標法計算，結(jié)果見表5。《中國藥典》（2010版）規(guī)定藥品中殘留溶劑甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、DMF的限度分別為0.3%、0.5%、0.5%、0.06%、0.088%，由表可知3批SCU中5中溶劑的殘留量均在限度范圍內(nèi)，符合標準。

表5 樣品測定結(jié)果

4 討論

進樣方式的選擇：頂空進樣可以避免講樣品的中的難溶性物質(zhì)引入色譜柱中，減小對柱子的污染，可以延長柱子的壽命，且甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷均為低沸點溶劑，N，N-二甲基甲酰胺雖沸點較高，但使用頂空進樣也可滿足檢測要求，故選擇進樣方式為頂空進樣。

本方法簡便、靈敏，精密度、重復(fù)性、回收率等均符合《中國藥典》2010年版的要求。故本方法適用于燈盞花乙素中5種有機溶劑的檢測。

由樣品測定的結(jié)果可以看出，3批SCU中5中殘留溶劑均在限度范圍內(nèi)，但丙酮的含量均較多，分別為0.482%、0.493%、0.400%，已快達到藥典規(guī)定的限度，故在合成的過程中應(yīng)加以控制。

[1]崔建梅，吳松.燈盞花素的研究進展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2003，15（3）：255-258.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[M].北京：化學工業(yè)出版社，2010：附錄63.

[3]田智慧，王連堯，李守申，等.毛細管氣相色譜法測定氨曲南中4中有機溶劑殘留量 [J].中國藥學雜志，2008，41（16）：1272-1273.

[4]洪麗婭，沈紅燕，王建.毛細管氣相色譜法測定鹽酸頭孢他美酯中殘留溶劑 [J].醫(yī)藥導報，2010，29（10）：1349-1351.