EphA4在人上皮性卵巢癌中的表達及臨床意義*

王玉樓，張靜艷，溫秋婷△

(1．齊齊哈爾醫學院第一附屬醫院普外一科，黑龍江齊齊哈爾161042;2．齊齊哈爾醫學院臨床病理診斷中心，黑龍江齊齊哈爾161006)

卵巢癌是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，發病率呈逐年增高的趨勢，且發病年齡有年輕化的傾向［1］。卵巢癌的發病和進展隱匿，往往在確診時已為晚期，因此尋找更好的與預后有關的分子標志物及治療靶點顯得尤為重要。生促紅素肝細胞受體激酶(Erythropoietin producing hepatocellular carcinoma cell line，Eph)是酪氨酸蛋白激酶受體(receptor tyrosine kinases，PTKs)家族中的最大的分支，有研究顯示Eph家族蛋白與腫瘤的發生和腫瘤血管的形成有關［2-3］。本研究采用免疫組化法檢測E-phA4蛋白，用原位雜交檢測EphA4mRNA在卵巢腫瘤中的表達，并分析其與卵巢癌的生物學行為之間的關系。

1 材料和方法

1．1 材料

收集我院病理科2006年1月至2011年12月存檔的原發性卵巢癌根治術手術標本84例，常規石蠟包埋?；颊吣挲g32～76歲，平均年齡51．4歲±6．9歲。淋巴結轉移者52例，無轉移者32例。臨床分期:Ⅰ期10例、Ⅱ期6例、Ⅲ期51例、Ⅳ期17例。病理學分級:高分化17例，中分化26例，低分化41例。病理類型:漿液性腺癌51例、粘液性腺癌28例、內膜樣腺癌5例。以20例卵巢良性腫瘤(卵巢漿液性囊腺瘤及粘液性囊腺瘤)作為對照組。

1．2 EphA4蛋白的檢測

免疫組織化學SP法，EphA4兔抗人多克隆抗體購自天津賽爾生物公司，工作液濃度為1:100，SP免疫組化試劑盒購自北京中杉公司，PBS代替一抗作為陰性對照，嚴格按說明書進行操作。

1．3 EphA4mRNA 的檢測

非放射性地高辛標記cDNA為探針進行原位雜交實驗，原位雜交試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。實驗所用玻璃器皿均經180℃烘烤8h，以消除RNA酶。雜交過程:組織切片常規二甲苯脫蠟，系列酒精復水，3%H2O2室溫10min，3%檸檬酸稀釋的胃蛋白酶室溫消化30min。每張切片滴加20μL預雜交液，將濕盒置于37℃恒溫箱中孵育4h。每片滴加20μL雜交液，38℃～42℃恒溫箱過夜。雜交后用預熱的SSC洗滌，37℃封閉30min。滴加生物素化鼠抗地高辛于37℃作用60min，加入SABC 37℃作用20min，滴加生物素化過氧化物酶37℃作用20min，DAB顯色，蘇木素復染。

1．4 結果判定

原位雜交及免疫組化染色均用DAB顯色，二者均以出現棕黃色顆粒為陽性染色。每例各觀察兩張切片，避開腫瘤邊緣和壞死區各隨機計數10個高倍視野，結果以染色強度和陽性細胞的百分數來判定:細胞未見棕黃色顆?；蜿栃约毎麛担?0%為陰性“-”，著色淺或陽性細胞數占11%～25%記“+”，著色深黃或陽性細胞數占26%～50%記“++”，著色為棕色或陽性細胞數＞50%記“+++”［4］。

1．5 統計學方法

采用 SPSS19．0統計軟件，EphA4蛋白和 E-phA4mRNA在卵巢腫瘤中陽性表達率的比較，E-phA4蛋白和EphA4mRNA的表達與卵巢癌的臨床病理特征的關系采用卡方檢驗，P＜0．05具有統計學意義。

2 結果

2．1 EphA4蛋白在卵巢腫瘤組織中的表達情況

免疫組化檢測結果，EphA4的表達主要位于細胞漿和細胞膜(圖1)，在卵巢癌中的陽性表達率為78．57%(66/84);而20例良性卵巢病變中，陽性率為25．0%(5/20)，且均為弱表達，兩者比較差異有統計學意義(χ2=21．401，P ＜0．01)(表1)。

圖1 EphA4蛋白在卵巢良性腫瘤和卵巢癌中的表達(×400)Figure 1 EphA4 protein expression in benign ovarian tumor and epithelial ovarian cancerA:Benign ovarian tumor;B:Well differentiated epithelial ovarian cancer;C:Poor differentiated epithelial ovarian cancer

表1 EphA4在卵巢癌和卵巢良性腫瘤組織中的表達Table 1 EphA4 protein expression in epithelial ovarian cancer and benign ovarian tumor

卵巢癌中EphA4的陽性表達率78．57%(66/84)明顯高于卵巢良性腫瘤中的表達率25．0%(5/20)(χ2=21．401，P ＜0．01)。

2．2 EphA4蛋白陽性表達和臨床病理資料的關系

EphA4蛋白的表達在卵巢癌組織學分級，臨床分期和淋巴結轉移在分組比較中差異具有統計學意義(P＜0．01)。晚期卵巢癌(Ⅲ+Ⅳ期)的陽性表達率86．76%明顯高于早中期卵巢癌(Ⅰ+Ⅱ期)的陽性表達率 43．75%(P ＜0．01);有淋巴結轉移組88．46%明顯高于無淋巴結轉移組62．50%(P＜0．01);隨著卵巢癌病理分級的升高，EphA4蛋白的表達逐漸增加，中低分化卵巢癌的陽性表達率85．07%高于高分化卵巢癌的陽性表達率52．94%(P ＜0．05)。見表2。

表2 EphA4蛋白表達與上皮性卵巢癌臨床病理特征之間的關系Table 2 The relationship between EphA4 protein expression and clinicopathological characteristics in epithelial ovarian cancer

2．3 EphA4mRNA在卵巢腫瘤組織中的表達情況

EphA4mRNA的陽性信號主要位于胞漿。良性卵巢腫瘤、高分化卵巢癌、低分化卵巢癌的陽性率分別為 19．43%、47．06%、86．57%，差異有顯著的統計學意義(P＜0．01)。EphA4mRNA的表達與臨床病理資料的關系，在卵巢癌的組織學分級，臨床分期和淋巴結轉移的分組比較中有統計學意義(P＜0．05)，而與患者的年齡，組織學分型及有無腹水無明顯相關性(P ＞0．05)。

表3 EphA4mRNA的表達與上皮性卵巢癌臨床病理特征之間的關系Table 3 The relationship between EphA4mRNA expression and clinicopathological characteristics in epithelial ovarian cancer

圖2 EphA4mRNA在卵巢良性腫瘤和卵巢癌中的表達(×400)Figure 2 EphA4 mRNA expression in in benign ovarian tumor and epithelial ovarian cancerA:Benign ovarian tumor;B:Well differentiated epithelial ovarian cancer;C:Poor differentiated epithelial ovarian cancer

3 討論

細胞信號傳導途徑在腫瘤的發生發展過程中機制的研究，是目前腫瘤研究的熱點。信號傳導通路中各蛋白質的磷酸化和去磷酸化是信號轉導的最重要調控方式之一，負責這一修飾調節的是蛋白激酶與蛋白磷酸酶。生促紅素肝細胞受體激酶(Eph)及其配體ephrin是酪氨酸激酶受體家族(RTKs)中最大的亞家族，根據Eph亞族各成員的同源性，表達分布以及結合配體的不同，可將其分為EphA和EphB亞型，相應的配體也有兩個亞型ephrinA和ephrinB，EphA4受體既可與ephrinA類配體結合，還可與ephrinB2和ephrinB3結合［5］。

EphA4/ephrin作用體系，通常以較低的水平表達于成人各種上皮細胞中，能夠潛在激活雙向信號傳導通路和細胞效應，分別充當“受體”和“配體”兩個角色，參與調節細胞的增生、遷移、變形和粘附等，還參與調節軸突導向、突觸形成等神經發育過程。近年來發現其在腫瘤演進過程中也有重要作用，可能參與調節腫瘤細胞的生長、粘附、變形及血管生成等過程，影響腫瘤的進展和轉移，而且還可能與腫瘤的血管生成有關［6］。

研究發現EphA/ephrin在許多腫瘤組織中的表達明顯高于相應正常組織，提示EphA/ephrin可能與腫瘤的許多惡性生物學行為相關，如腫瘤的侵襲性和轉移能力增強，并可能參與促進腫瘤血管形成［7］。以往的研究發現在人類前列腺癌和胰腺癌組織中，有EphA4受體的高表達［8］;EphA4受體的高表達與胃癌的進展和轉移相關［9-12］。本研究在轉錄和翻譯水平檢測EphA4基因和EphA4蛋白在卵巢腫瘤中的表達，結果顯示EphA4mRNA及E-phA4蛋白在卵巢癌中的表達明顯高于卵巢良性腫瘤(P＜0．01)。EphA4蛋白和EphA4mRNA的表達在卵巢癌的組織學分級，臨床分期和淋巴結轉移的分組比較中差異具有統計學意義(P＜0．05)，而與患者的年齡、組織學分型及有無腹水等無明顯相關性(P＞0．05)。EphA4蛋白在晚期卵巢癌(Ⅲ+Ⅳ期)的陽性表達率86．76%明顯高于早中期卵巢癌(Ⅰ +Ⅱ期)的陽性表達率 43．75%(P ＜0．01)，并且隨著卵巢癌分化程度的降低，EphA4的表達逐漸增加，差異有統計學意義(P＜0．01)。一些研究表明，將EphA4基因轉染至胰腺癌細胞系后，高表達的EphA4受體使癌細胞的生長速度變快［8］，如將EphA4的siRNA轉染至胰腺癌細胞后，可以大大降低胰腺癌細胞的生存能力，提示Eph基因可能成為腫瘤生物治療的靶點［13］。并且EphA4/ephrin還可能通過血管生成因子和血管生成素促使腫瘤血管的大量產生［14］，為腫瘤的生長提供所需營養，同時也為腫瘤的轉移開辟了潛在的途徑。

綜上所述，EphA4在卵巢癌的發生發展中發揮著重要的作用，其作用機制尚不完全明確。進一步研究EphA4在卵巢癌中的作用機制有助于探索卵巢癌治療更有效的分子靶點。同時進一步明確E-phA4基因對卵巢癌患者預后的影響，有助于對預后較差的卵巢癌患者亞群進行更加積極的干預措施。

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