氟尿嘧啶和奧沙利鉑在胃癌中的體外化療敏感性檢測*

陳小東，趙 平，丁 志，周 祥，肖碩萌，唐令超

(四川省腫瘤醫院·研究所胃腸外科，成都610041)

胃癌是我國常見惡性腫瘤之一，最新的癌癥登記數據表明其年發病率為36．21/10萬人(男性49．61/10萬人，女性 22．50/10 萬人)，年新增病例約40．5萬人，居惡性腫瘤第二位(構成比為12．67%);死亡率為 25．88/10 萬人(男性 34．64/10萬人，女性16．91/10萬人)，年死亡人數約32．5萬人，居惡性腫瘤第三位(構成比為 14．33%)［1-2］。由于沒有開展廣泛的人群早期篩查，我國早期胃癌的診斷率很低，多數患者發現晚，確診時已屬進展期，部分患者甚至已屬不能手術切除或有遠處轉移僅能行姑息性化療的晚期病例，即使行了根治性切除的患者，大部分也需要輔助性化療［3］。系統評價及Meta-分析顯示根治術后的輔助化療可以顯著降低復發率、提高治愈率，而晚期胃癌的姑息化療也可以延長生存期并改善生活質量［4-5］。然而，目前胃癌化療的有效率較低，輔助化療僅能提高治愈率10%左右，而姑息化療的有效率也僅為10%～50%，其根本原因可能在于胃癌是高度異質性的一類腫瘤，建立在群體樣本研究基礎上的“標準化療方案”沒有考慮到個體的差異性［6］。因此，為進一步提高化療的有效性就要求從“標準化”向“個體化”發展。目前，體外腫瘤化療藥物敏感性檢測是實現個體化治療的有效措施之一。本研究采用三磷酸腺苷腫瘤化療藥物敏感性檢測法(ATP-TCA)對27例新鮮胃癌手術標本進行體外化療敏感性檢測，以期為術后化療方案的選擇提供指導。

1 材料與方法

1．1 患者

本研究納入的患者為2014年1月至2014年6月在我院經胃鏡活檢初次確診的胃癌患者，術前簽署書面知情同意書，同意行化療藥物敏感性檢測。排除行術前新輔助化療或同時診斷患有其他惡性腫瘤的患者。所有患者均行胃切除術加D2淋巴結清掃術。使用設計好的數據表前瞻性錄入患者的臨床病理特征，包括年齡、性別、腫瘤位置、Bormann分型、組織學分類、術后TNM分期、脈管侵犯及神經侵犯等［7］。術前結合胃鏡及CT按腫瘤主體所在部位判定腫瘤位置，并經術中證實或修正。

1．2 主要儀器和試劑

高靈敏度板式化學發光檢測儀(OrionⅡ，德國Berthold Detection Systems公司)、低速大容量離心機、倒置顯微鏡、超凈臺、CO2培養箱、96孔細胞培養板;ATP生物熒光腫瘤藥物敏感性檢測試劑盒(湖州海創生物科技有限公司)、完全培養液(CAM)、腫瘤組織消化酶(TDE)、ATP抽提劑(TCE)、紅細胞裂解液、熒光素-熒光素酶工作液和ATP標準液。

1．3 體外化療藥物敏感性檢測

新鮮的胃癌標本取材后放入一次性的培養皿中，吹打標本并吸去浸泡液;加75%酒精浸沒標本并吹打1～2分鐘，吸去酒精，在含抗生素(青霉素200U/ml和鏈霉素200U/ml)的培養基中浸泡25分鐘后，吸去浸泡液，用剪刀鑷子剪成糊狀，肉眼基本看不到顆粒，置于15ml離心管中，加入6ml含混合消化酶的培養基，于37℃消化2h。200目篩網過濾，獲得單細胞懸液，用培養基洗滌2次。臺盼藍染色進行活細胞計數。

先加待測藥物于96孔培養板，所用藥物及100%TDC(測試藥物濃度)參考藥物在人體內的血漿濃度設定為:氟尿嘧啶(5-FU 25μg/ml)、奧沙利鉑(OX 5μg/ml)，聯合用藥的每個藥物濃度與單藥濃度相同［8-9］。每個藥物設200%、100%、50%、25%、12．5%TDC五個濃度，每個濃度2個平行孔，并設2排(8孔)無藥孔作對照，一排為無藥對照(M0)，一排為空白對照(MI)，僅200ul完全培養基，作為檢測本底值。接種腫瘤細胞，細胞數為2×104個/孔。在37℃、5%CO2條件下培養5天后，按試劑盒說明書操作測定熒光值。

1．4 結果參數及敏感性判定標準

檢測系統軟件自動分析每種測試藥物濃度(Test Drug Concentration，TDC)的腫瘤生長抑制率(Tumor Growth Inhibition Rate，TGI)，繪制藥物濃度-腫瘤細胞生長抑制曲線(橫坐標X軸為TDC，縱坐標Y軸為TGI)，計算抑制曲線下面積(area under the curve，AUC)、化療敏感指數(chemosensitivity index，CSI)、IC50 及 IC90，其計算方法如下:

TGI:(1-藥物處理孔熒光均值/無藥對照孔熒光均值)×100%。

AUC:按梯形法則進行X、Y軸坐標計算測試藥物濃度(TDC)百分比VS抑制腫瘤生長(TGI)百分比，其值越大代表這個化療藥物對腫瘤細胞的抑制性越好。

CSI:CSI=500-各TDC的抑制率之和，其值越小表示這個化療藥物對腫瘤細胞的抑制率高。

IC90:抑制90%腫瘤細胞生長的TDC。IC50:抑制50%腫瘤細胞生長的TDC。

化療敏感性根據以下三種進行分類:敏感:IC50≤25%TDC;輕度敏感:IC90≤100%TDC且IC50＞25%，或CSI≤300;耐藥:IC90＞100%TDC且 IC50＞25%且 CSI＞300。

1．5 統計學方法

計數資料采用例數及百分比表示，不同化療藥物之間的比較采用兩相關樣本Wilcoxon符號秩檢驗(Two-Related-Samples Wilcoxon Signed Ranks test);計量資料采用均數±標準差(Mean±SD)表示，不同化療方案之間的比較采用隨機區組設計的方差分析，并采用LSD法進行兩兩比較;多因素分析采用Logistic回歸分析，采用逐步向前法(Forward Stepwise)選擇變量進入回歸模型，并依據似然比(Likelihood Ratio)檢驗的結果剔除變量，在結果中僅將納入回歸模型的變量列出。以P﹤0．05為有統計學意義。所有統計學操作采用SPSS 16．0完成。

2 結果

2．1 納入患者的臨床病理特征

共納入27例患者，其中老年患者14例(51．9%)、男性21例(77．8%)、腫瘤位于遠側部14 例(51．9%)、低分化及印戒細胞癌共20例(74．1%)、TNM Ⅲ+Ⅳ期21例(77．8%)(見表1)。

表1 患者的臨床病理特征

特征 例數(n=27)%TNM 分期Ⅰ期 3 11．1Ⅱ期 3 11．1Ⅲ期 18 66．7Ⅳ期 3 11．1脈管侵犯否19 70．4是8 29．6神經侵犯否19 70．4是8 29．6

2．2 體外化療敏感性檢測結果

2.2.1 腫瘤生長抑制率(TGI) 三種化療方案不同TDC對來自同一標本的腫瘤細胞生長具有抑制作用(見圖1)，抑制作用高低依次是5-FU+OX、OX和5-FU，而且后兩條抑制曲線較為接近。

圖1 腫瘤生長抑制曲線

三種化療方案TDC越高對胃癌細胞生長的抑制率也越高，且5-FU+OX在各個TDC的TGI均顯著高于5-FU或OX(見表2)。

2.2.2 TGI相關參數及化療敏感性判定 5-FU+OX的AUC均顯著高于5-FU或OX，而其CSI、IC90和IC50顯著低于5-FU或OX。5-FU、OX及5-FU+OX的敏感性(敏感 +輕度敏感)依次為18．5%、14．8%及55．6%，5-FU+OX的敏感性顯著高于5-FU 或 OX(5-FU+OX vs．5-FU:P=0．001 和5-FU+OX vs．OX:P=0．003)(見表 3)。

三種化療方案的CSI頻率直方圖顯示其分布近似于正態分布，敏感性較高的5-FU+OX的峰值更靠左(見圖2)。

表2 四種化療方案不同藥物濃度(TDC)的腫瘤生長抑制率(TGI)

表3 TGI相關參數及化療敏感性判定結果

圖2 三種化療方案的CSI頻率直方圖

2．3 多因素回歸分析

將表1所列臨床病理特征納入多因素回歸分析顯示，盡管對5-FU敏感的均為遠側部胃癌，但單因素分析(Fisher's Exact Test:P=0．078)及多因素分析(P=0．998)均顯示無顯著相關性;OX的敏感性與Borrmann分型有顯著相關性(P=0．025)，BorrmannⅢ、Ⅳ型高于Ⅱ型(OR=7．570);5-FU+OX的敏感性與腫瘤位置有顯著相關(P=0．019)，遠側部胃癌中的敏感性顯著高于近側部(OR=3．427)(見表4)。

表4 化療敏感性相關因素分析

3 討論

盡管根治性手術仍是目前唯一有可能治愈胃癌的治療措施，但是術后輔助化療的作用也逐漸得到了廣泛認可，其目的是為了防止微小殘留腫瘤復發。一項國際協作的針對較早期的隨機對照試驗的meta-分析顯示:輔助化療使胃癌患者的5年無疾病生存率提高5．3%(從48．7% 到 54．0%)，5 年和10年總生存率分別提高5．8%(從49．6%到55．3%)和 7．4%(從 37．5%到 44．9%)，中位生存時間延長2．9 年(從 4．9 到7．8 年)［10］。

近年由于化療新藥的出現，輔助化療的效果有了進一步提高。日本進行的ACTS-GC試驗采用S-1單藥輔助化療，結果顯示與單純手術相比，3年和5年無疾病生存率分別提高12．6%(從59．6%到72．2%)和12．3%(從 53．1% 到 65．4%)，3 年和 5年總生存率分別提高10．0%(從70．1% 到80．1%)和 10．6%(從 61．1% 到 71．7%)［11-12］。而中韓兩國進行的CLASSIC試驗采用卡培他濱加奧沙利鉑的聯合方案輔助化療，結果顯示與單純手術相比，3年無疾病生存率提高15%(從59%到74%)，3年總生存率提高5%(從78% 到83%)［13］。

基于大樣本的Ⅲ期臨床隨機對照試驗結果，美國國家綜合癌癥網絡2014年NCCN指南推薦的輔助化療方案為卡培他濱加奧沙利鉑或順鉑的聯合方案［14］，日本胃癌學會2010年第三版胃癌治療指南推薦的是S-1單藥［15］，而我國衛生部制定的2011年版《胃癌診療規范》推薦氟尿嘧啶類聯合鉑類的兩藥聯合方案［16］。盡管目前胃癌輔助化療取得了可喜的進步，但遠未達到令人滿意的程度，因為大量接受根治性手術及輔助化療的患者仍然出現復發。除了進一步開發更敏感的化療藥之外，如何更充分有效地發揮現有藥物的作用卻是更現實的做法。分子靶向藥物的廣泛使用開啟了腫瘤“個體化”治療的大門，同樣，在尋找“標準化療方案”的同時，“個體化化療”的理念也逐漸興起。

體外化療敏感性檢測可以為化療藥物的個體化選擇提供參考，多項臨床研究證實其有較高的臨床符合率，在多種腫瘤的治療中取得了明顯的效果［17-18］。數項來自韓國的研究也初步表明了ATP-TCA法在胃癌治療中的價值［19-22］。基于前述指南推薦的術后輔助化療方案及我們目前臨床實踐的實際情況，我們采用ATP-TCA法檢測了5-FU、OX及5-FU+OX在胃癌中的敏感性，結果表明5-FU+OX顯示出比5-FU或OX更高的體外化療敏感性。然而，需要特別注意的是體外試驗并不能完全模擬體內環境。實際上，藥物的體內過程十分復雜，不同的給藥途徑(如靜脈注射、滴注、持續泵入或口服給藥)會影響藥物的吸收及分布，藥物進入體內后還要經歷獨特而復雜的藥代動力學和藥效動力學過程;體外試驗模型則是高度理想化和簡單化的體系，只能在一定程度上模擬體內的環境，在本研究中測試藥物濃度即是對藥物在人體內的血漿濃度值的等效轉換，然而，這種等效轉換卻并不能直接等同于體內療效。有鑒于此，我們也正在對體外試驗的結果與體內療效的相關性進行長期的臨床觀察。

影響胃癌預后的因素包括治療措施、TNM分期、腫瘤位置、分化程度、脈管侵犯、種族、性別及年齡等，近側部胃癌是不良預后因素，而亞洲人、女性及年輕為良好的預后因素［23］。本研究采用多因素回歸分析發現OX和5-FU+OX的敏感性分別與Borrmann分型和腫瘤位置有顯著相關性。因為本研究病例數較少，尚難以做出肯定的結論，因此需要增加病例數進一步驗證。然而，值得注意的是，既往的臨床研究表明近側胃癌的預后比遠側胃癌差［24］，而我們的研究也表明5-FU及5-FU+OX的化療敏感性在遠側部胃癌中較高，這是否與臨床預后相關也有待進一步驗證。

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