四川省女性ERα基因多態性與乳腺癌風險關系的病例對照研究

曹蘭青，李 卉，劉 莉，王 瓊，李冬鋒，齊亞娜，李 卉△，李佳圓

(1．成都市婦女兒童中心醫院，成都610041;2．四川省腫瘤醫院，成都610041;3．四川大學華西公共衛生學院，流行病與衛生統計學系，成都610041)

乳腺癌的發生發展與女性體內雌激素暴露密切相關。雌二醇(estradiol，E2)通過與廣泛分布在乳腺細胞核內的雌激素受體(estrogen receptor，ER)結合，促進乳腺細胞和組織的增殖分化。ER在乳腺組織的雌激素應答反應中起重要的調節作用。研究發現人類正常乳腺組織ERα表達或功能的改變可能會影響乳腺癌發生風險［1］。XbaⅠ(rs9340799)、PvuⅡ(rs2234693)是人群研究較為關注的ERα基因多態性位點，均位于ERα基因第1內含子內，分別在第2外顯子上游351bp和397bp處發生A/G(x/X)、C/T(P/p)基因突變［2］。有研究者認為上述基因突變可能會影響乳腺細胞ERα基因外顯子區域mRNA選擇性剪接，從而改變ERα蛋白質功能［3］。目前國內外關于XbaⅠ、PvuⅡ基因多態性與乳腺癌患病風險的人群研究結論尚不一致［4-13］。因此本研究采用病例對照研究設計探討四川漢族女性XbaⅠ、PvuⅡ基因多態性與乳腺癌患病風險的關系，并進一步分析二者的聯合作用。

1 對象及方法

1．1 研究對象

2010年10月至2012年7月，采用便利抽樣收集來源于四川省腫瘤醫院經組織病理學診斷的原發性乳腺癌新發病例。對照組來源于成都市婦女兒童醫學中心的健康體檢女性。調查對象均簽署知情同意書。

病例組:納入標準:(1)年齡為30～70歲;(2)居住于四川省10年以上。排除標準:(1)轉移性乳腺癌患者;(2)精神疾病患者;(3)內分泌疾病患者。

對照組:納入標準:(1)年齡為30～70歲;(2)均居住于四川省10年以上。排除標準:(1)有放射線等職業暴露史者;(2)惡性腫瘤患者;(3)內分泌疾病患者;(4)生殖系統疾病患者;(5)精神疾病患者。

1．2 調查內容

采用問卷調查收集研究對象的一般人口學特征、身高、體重、月經史、生育史、雌激素藥物服用史等常見乳腺癌危險因素信息。

1．3 基因型檢測

PCR反應:采用EDTA抗凝管收集研究對象的外周靜脈血5ml。采用天根生化科技(北京)有限公司全血基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。采用限制性片段長度多態性技術(RFLP)檢測XbaⅠ(rs9340799)、PvuⅡ(rs2234693)基因多態性。目的基因擴增采用巢式PCR技術，利用Primer Premier 5．0引物設計軟件設計PCR引物。外側引物:上游5-CTGCCACCCTATCTGTATCTTTTCCTATTCTCC-3;下游5-TCTTTCTCTGCCACCCTGGCGTCGATTATCTGA-3。內側引物:上游5-AGGCTGGGCTCAAACTACAG-3’，下游 5-CTCTGGGAGATGCAGCAGAT-3’。引物設計參照陸旭［9］、宋傳貴［14］等的研究。內、外側PCR反應體系總量均為 25μl，包括 1μl模板(0．1ng/μl)，1μl前引物(10μmol/L)，1μl后引物(10μmol/L)，12．5μl 2 × Taq PCR master Mix(含染料)，9．5μl RNase-free water。引物由北京 invitrogen英杰生命技術公司合成，其他試劑購自北京康為世紀生物科技有限公司。外側PCR反應條件為:95℃預變性3分鐘，95℃變性30秒，60．9℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，循環30次，最終72℃延伸10分鐘。內側PCR反應條件為94℃預變性2分鐘，94℃變性30秒，54．6℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，循環30次，最終72℃延伸7分鐘。

PCR產物酶切:采用 XbaⅠ內切酶(1U/μl)、PvuⅡ內切酶(1U/μl)對目的位點進行酶切。酶切體系包括:31μl酶切體系，包括10μlPCR產物、1μl XbaⅠ或 PvuⅡ內切酶(1U/μl)、2μl10 × Buffer Tango或Buffer G、18μl滅菌超純水。所有試劑均購自北京康為世紀生物科技有限公司。將配制好的酶切體系置于37℃恒溫水浴箱內酶切4至16小時，取出后滴加1．31μl0．5MEDTA 終止反應。

瓊脂糖凝膠電泳:配制1．5%瓊脂糖凝膠進行凝膠電泳。取10μl酶切反應產物和2μl溴酚藍上樣緩沖液混合后，加入點樣孔內，100V恒壓電泳40分鐘，凝膠成像系統紫外燈下觀察結果。

基因型判定:XbaⅠ電泳結果僅出現一條316bp的條帶，為野生純合型(xx);存在615bp和316bp兩條帶，為突變雜合型(Xx);僅出現一條615bp的條帶，為突變純合型(XX)，見圖1。PvuⅡ電泳結果僅出現一條615bp的條帶，為野生純合型(PP);存在615bp和271bp，344bp三條帶，為突變雜合型(Pp);僅出現271bp和344bp兩條帶，為突變純合型(pp)，見圖2。

1．4 質量控制

隨機抽取5%研究對象于調查兩周后重新進行問卷復核，兩次回答一致率為90%。隨機抽取10%的樣本進行基因型重復檢測，重測結果一致率為100%。PCR片斷經DNA測序證明無誤。

1．5 統計分析

采用 Epidata3．0建立數據庫。采用 Spss17．0軟件對數據進行統計分析。采用頻數及構成比描述XbaⅠ、PvuⅡ基因型及等位基因的分布，并檢驗對照組基因型分布是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。將本次研究樣本人群的XbaⅠ、PvuⅡ基因型分布與Hapmap數據庫中國人群數據進行比對。采用χ2檢驗比較病例組與對照組乳腺癌危險因素的分布差異，篩選出有統計學意義的協變量。檢驗

圖1 XbaⅠ各基因型電泳圖

2 結果

2．1 乳腺癌病例組和對照組一般情況及常見危險因素的組間比較

本次研究共納入病例221例，對照252例。病例組平均年齡(48．25±10．04)歲，對照組平均年齡為(47．52 ±9．31)歲，年齡差異無統計學意義(t=-0．83，P=0．41)。病例組絕經前161例(63．9%)，絕經后水準為雙側α=0．05。采用非條件多因素 logistic回歸評價XbaⅠ、PvuⅡ基因多態性與乳腺癌患病風險的關系。采用分層分析估計基因與基因間的聯合效應。按照絕經狀態進行亞組分析。91 例(36．1%);對照組絕經前 130 例(58．8%)，絕經后91例(41．2%);經檢驗，絕經狀態在病例對照組間分布無統計學差異(χ2=1．28，P=0．26)。χ2檢驗結果顯示總人群中，文化程度、家庭人均月收入、職業、BMI、初產年齡、哺乳、活產數等變量組間分布具有統計學差異(P＜0．05)(表1)。絕經前后亞組危險因素篩選結果詳見表1。

圖2 PvuⅡ各基因型電泳圖

表1 乳腺癌一般危險因素變量篩選結果

表2 XbaⅠ、PvuⅡ基因多態性與乳腺癌患病風險的關系

表3 XbaⅠ、PvuⅡ對乳腺癌患病風險聯合作用的分層分析結果

2．2 XbaⅠ、PvuⅡ基因型分布與比較

對照組XbaⅠ、PvuⅡ基因型頻率均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(Xba Ⅰ:χ2=0．001，P=0．98;Pvu Ⅱ:χ2=1．23，P=0．27)。Hapmap 數據庫中中國人群XbaⅠ各基因型攜帶率分別為0．65(xx)、0．25(Xx)和 0．10(XX);Pvu Ⅱ各基因型攜帶率為0．20(PP)、0．40(Pp)和 0．40(pp)，與本次研究樣本人群中基因型分布基本一致。多因素Logistic回歸結果顯示，在總人群、絕經前及絕經后女性中，各位點以野生純和型為參照，突變雜合型及突變純和型與乳腺癌風險無關(P＞0．05)。顯性遺傳模型(Xx+XX vs．xx;Pp+pp vs．PP)也未發現 XbaⅠ、PvuⅡ突變等位基因與乳腺癌患病風險的關系(P ＞0．05)(表2)。

2．3 XbaⅠ、PvuⅡ基因多態性聯合作用分析結果

多因素Logistic回歸結果顯示，以xxPP野生基因型組合為參照，在總人群中，只攜帶p等位基因與乳腺癌患病風險無統計學關聯(OR=0．46，95%CI:0．19～1．10)，而只攜帶 X等位基因能明顯降低乳腺癌患病風險(OR=0．31，95%CI:0．11～0．90)，其效應大小與同時攜帶X、p等位基因效應接近(OR=0．39，95%CI:0．15～1．00)。在絕經前亞組中，只攜帶 X 等位基因(OR=0．12，95%CI:0．03～0．54)以及 X、p 聯合暴露(OR=0．25，95%CI:0．07～0．89)均能降低乳腺癌風險。(詳見表3)。

3 討論

XbaⅠ、PvuⅡ位點存在于ERα第一內含子內，并不直接參與ERα基因轉錄翻譯過程。Maruyama等［15］將1．3kbp ERα基因序列插入螢光素酶報告基因載體(pGL3)中，發現攜帶x等位基因的熒光素酶活性高于 X等位基因。Herrington［16］等發現 P等位基因與ERα蛋白髓細胞瘤(B-myb)轉錄因子結合位點暴露有關，可提高下游外顯子區轉錄活性。

本次研究在總人群、絕經前及絕經后女性中未觀察到XbaⅠ、PvuⅡ基因多態性影響乳腺癌患病風險的獨立效應。這與此前來自中國和歐洲的部分人群研究結論一致［2，4-8］。但也有研究觀察到乳腺癌患病風險與XbaⅠ基因多態性的關系。陸旭［9］等在中國北方漢族女性中、Shin［10］等在韓國女性中，Andersen［11］在挪威女性中均發現 X等位基因攜帶者乳腺癌患病風險明顯降低。此外，有部分研究觀察到乳腺癌患病風險與PvuⅡ基因多態性的關系。來自上海［12］和日本［13］的的大樣本病例對照研究均發現，P等位基因對乳腺癌的保護作用。由此可見，XbaⅠ、PvuⅡ基因多態性與乳腺癌患病風險關系在各人種中仍得到不同的結論。研究間結論不一致的原因可能與各研究樣本量差異和樣本代表性有關。國內外多數人群研究發現的XbaⅠ、PvuⅡ易感基因型具有臨界風險效應(OR＜2，OR 95%CI下限接近1)，說明這兩個位點多態性對乳腺癌風險的貢獻較弱。

本研究對兩個位點的協同作用分析發現在總人群及絕經前人群中，與攜帶xxPP野生基因型組合相比，只攜帶X等位基因能明顯降低乳腺癌患病風險，其效應與同時攜帶X、p等位基因非常接近。這提示X等位基因對乳腺癌患病風險具有保護效應，但兩位點間可能并不存在交互效應。本研究觀察到X等位基因的保護效應在絕經前女性中更為明顯。可能的原因是ERα參與乳腺細胞雌激素應答調解，故ERα蛋白表達或功能的改變對絕經前女性影響更大。近年來有研究發現XbaⅠ、PvuⅡ位點之間存在遺傳連鎖不平衡，且xp單倍體可增高乳腺癌患病風險。因此，后續研究應進行連鎖不平衡及單體型分析，探討XbaⅠ、PvuⅡ對中國女性乳腺癌患病風險影響的作用模式，更加全面地揭示這兩個位點與乳腺癌患病風險的關系。

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