Beclin-1表達對舌癌細胞Tca8113順鉑敏感性的影響

陳偉泉，譚廣謀，黃文喜，黃海燕

(廣州醫科大學附屬腫瘤醫院，廣州510095)

舌癌是一種較為常見的口腔頜面部惡性腫瘤，目前治療以手術(原發灶切除及頸部淋巴結清掃術)為主，圍術期輔以放化療，但化療耐藥的出現嚴重制約了舌癌的臨床治療。細胞在營養剝奪或其他細胞應激的刺激下可迅速產生大量自噬溶酶體，引發自噬潮、幫助細胞緩解應激或促進細胞凋亡［1］。Beclin-1是參與哺乳動物自噬體形成的關鍵因子［2］，而自噬在腫瘤的發生、發展、遠端轉移及化療耐受中發揮重要作用［3～5］。本研究觀察了Beclin-1表達對舌癌細胞Tca8113順鉑敏感性的影響，以期為舌癌的臨床治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 舌癌Tca8113細胞購自中國科學院上海細胞庫，接種于含10%新生牛血清的RPMI1640培養基中，置于37℃、5%CO2的培養箱中培養，至對數生長期后用于實驗;培養基RPMI1640、胰酶和新生牛血清購自Gibco公司，逆轉錄試劑盒購自TaKaRa公司，四唑化合物(MTS)購自Promega公司，順鉑、嘌呤霉素、氨基糖苷類抗生素G418購自Sigma公司，凝膠抽提試劑盒、無內毒素質粒抽提試劑盒Ⅰ購自廣州飛揚生物有限公司，BamHⅠ、MluⅠ和 HindⅢ限制性內切酶、蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑購自Fermentas公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Pierce公司，Beclin-1抗體、辣根過氧化物酶偶聯的羊抗兔IgG購自Santa Cruz公司;ECL化學發光試劑盒購自Millipore公司;引物及干擾片段均由Invitrogen公司合成，其余試劑購自廣州威佳生物有限公司。

1.2 過表達和干擾Beclin-1真核載體的構建 在NCBI上獲得Beclin-1(NM_003766.3)的序列，使用PP5軟件設計Beclin-1過表達的引物(名稱及序列略)，以Tca8113細胞cDNA為模板，PCR擴增得到Beclin-1片段。程序如下:94℃ 2 min，98℃ 10 s，68℃ 1 min，35個循環;72℃ 2 min。瓊脂糖凝膠回收目的片段，并將其與真核表達載體pLEX-MCS分別用限制性內切酶BamHⅠ和MluⅠ于37℃酶切3 h;瓊脂糖凝膠檢測酶切效果，回收酶切載體和DNA片段，T4 DNA ligase連接該DNA片段和載體，轉化大腸桿菌感受態DH5α，挑取單克隆送Invitrogen公司測序，鑒定陽性克隆。利用在線軟件BlockiTTM RNAi Designer設計Beclin-1的shRNA序列。在Invitrogen公司合成該干擾片段，95℃ 5 min退火(體系包括5× PCR Buffer 10 μL，上游shRNA序列20 μL，下游 shRNA 序列20 μL);BamH Ⅰ和 HindⅢ酶切載體 pRNAT-U6.1/neo，T4 DNA ligase連接退火片段和酶切后的載體，轉化DH5α，挑取單克隆測序，鑒定陽性克隆。RT-PCR和Western blotting法檢測重組載體對Beclin-1的干擾效果。

1.3 過表達和干擾Beclin-1的舌癌Tca8113細胞模型的建立 按照Endo-free plasmid mini kitⅠ試劑盒說明書操作，提取經測序鑒定的陽性克隆中的質粒，分別命名為pLEX-Beclin-1和pRNAT-Beclin-1-sh1、pRNAT-Beclin-1-sh2以及pRNAT-Beclin-1-sh3。瞬時轉染重組干擾質粒于Tca8113細胞中，RT-PCR和Western blotting方法鑒定各干擾質粒的沉默效果。將質粒pLEX-MCS和pLEX-Beclin-1轉染Tca8113細胞，48 h后加入嘌呤霉素(1 g/mL)，逐漸提高嘌呤霉素質量濃度，逐步篩選獲得穩定過表達Beclin-1的細胞系Tca8113/Beclin-1及對照細胞系Tca8113/pLEXMCS。同時將pRNAT-U6.1/neo和沉默效果最好的干擾質粒轉染Tca8113細胞，48 h后加入300 g/mL的G418，逐漸提高G418質量濃度，逐步篩選獲得穩定干擾Beclin-1的細胞系和對照細胞系。

1.4 順鉑干預及細胞存活率檢測 取上述對數生長期細胞，胰酶消化制成細胞懸液，調整細胞密度至3×104/mL，按100 μL/孔接種于 96 孔板中，37 ℃、5%CO2的培養箱中過夜。每孔加入質量濃度分別為0、1、2、4、8、16 mg/L 的順鉑100 μL(同時做6 個復孔)，72 h后每孔加入20 μL的MTS，37℃孵育2 h，多功能酶標儀檢測490 nm波長處的各孔吸光度A490，計算細胞存活率。實驗重復3次，取其結果的平均值。1.5 統計學方法 采用SPSS19.0進行統計學分析。計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 過表達和干擾Beclin-1真核載體的構建結果 成功構建過表達Beclin-1的真核載體pLEX-Beclin-1及干擾Beclin-1的真核載體pRNAT-Beclin-1-sh1、pRNAT-Beclin-1-sh2 和 pRNAT-Beclin-1-sh3。RT-PCR顯示 pRNAT-Beclin-1-sh1、pRNAT-Beclin-1-sh2和pRNAT-Beclin-1-sh3在mRNA水平對Beclin-1的干擾效果分別達到 76.74%、58.21%和 56.53%(P均＜0.05)。Western blotting顯示干擾質粒pRNAT-Beclin-1-sh1對Beclin-1的沉默效果最為明顯，見圖1。因此在后續的研究中僅使用質粒pRNAT-Beclin-1-sh1沉默Beclin-1。

圖2 過表達和干擾Beclin-1的穩定舌癌細胞模型

圖1 質粒轉染Tca8113細胞48 h后Beclin-1蛋白表達

2.2 過表達和干擾Beclin-1舌癌細胞模型的建立結果 用嘌呤霉素篩選獲得穩定過表達Beclin-1的細胞模型Tca8113/Beclin-1及對照組細胞模型Tca8113/pLEX-MCS。將 pRNAT-Beclin-1-sh1轉染入Tca8113，逐步用新霉素篩選獲得穩定干擾Beclin-1的細胞模型Tca8113/pRNAT-Beclin-1-sh1及對照組細胞模型Tca8113/pRNAT-U6.1/neo。RT-PCR顯示Beclin-1基因在細胞Tca8113/Beclin-1中的表達量是對照細胞的23.49倍(表達量分別為23.49±1.053、1.00 ±0.003)，在細胞 Tca8113/pRNAT-Beclin-1-sh1中的表達量較對照細胞下調81.64%(表達量分別為 0.18 ±0.001、1.00 ±0.016)，P 均 ＜0.01;Western blotting所示Beclin-1表達變化同上，見圖2。

2.3 Tca8113對順鉑的敏感性 Tca8113/pLEXBeclin-1及對組細胞Tca8113/pLEX-MCS對順鉑的半數抑制濃度(IC50)值分別為(11.99±0.34)、(5.03 ±0.16)mg/L，P ＜0.01;而 Tca8113/pRNATBeclin-1-sh1及對照細胞Tca8113/pRNAT-U6.1/neo對順鉑的 IC50值分別為(2.76 ±0.09)、(5.01 ±0.18)mg/L，P ＜0.01。

3 討論

細胞受到外界刺激或者細胞周期發生改變時即可引發一種程序性細胞凋亡——自噬。自噬是指從粗面內質網的無核糖體附著區脫落的雙層膜包裹部分胞質和細胞內需降解的細胞器、蛋白質等成分形成自噬體，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內容物，以實現細胞自身代謝和某些細胞器更新的需要［6］。越來越多的實驗證據表明，自噬與腫瘤的發生、發展密切相關［7，8］。

Beclin-1位于染色體17q21，可與Ⅲ型磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)的催化亞單位Vps34結合形成復合體，介導其他自噬蛋白定位于前自噬小體，被認為是自噬信號的“守門人”。作為激活自噬的一個重要分子，Beclin-1自身的磷酸化水平和表達量決定自噬水平［9］。Jiang 等［10］發現，35 份頭頸部腺樣囊性癌組織中32份表達Beclin-1蛋白，其中高表達率為42.9%、低表達率為57.1%，且與患者存活率呈正相關;Liang等［11］在89例頭頸部腺樣囊性癌組織中得到相同結論。在結腸癌細胞HCT116中，突變的Beclin-1無法被切割而不能引發自噬，可對抗化療藥物引起的細胞凋亡;在實體瘤中，Beclin-1突變能顯著降低腫瘤對化療的敏感性［12］。采用順鉑或者紫杉醇處理腫瘤細胞能夠激活細胞的自噬反應，但卻使miR-30水平降低;上調miR-30表達后Beclin-1介導的自噬作用顯著下調，順鉑誘導的細胞凋亡顯著增強［13］。低濃度(10 nmol/L)雷帕霉素可導致大鼠胚胎成纖維細胞NIH3T3停滯在G1期而引發細胞凋亡，但異位表達Beclin-1后mTOR下游的信號通路可激活自噬，逆轉雷帕霉素引起的細胞凋亡［14］。本研究建立了穩定過表達Beclin-1的舌癌細胞模型，且發現其對順鉑的敏感性較對照細胞顯著降低;建立了穩定干擾Beclin-1的舌癌細胞模型，且其對順鉑的敏感性較對照細胞顯著增加。提示提高Beclin-1表達有助于增強舌癌細胞對順鉑的耐受性，下調Beclin-1表達可增加舌癌細胞對順鉑的敏感性。此為闡述Beclin-1調控舌癌化療敏感性的分子機制提供了理論基礎。

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