非小細胞肺癌組織中EGFR、HER-2蛋白的表達變化及意義

李宗軍，沈 毅，唐東方，金翔鳳，王耀鵬，矯文捷，隋愛華，劉玉洪

(青島大學醫學院附屬醫院，山東青島266003)

肺癌是世界上病死率最高的惡性腫瘤之一，其中約85%是非小細胞肺癌(NSCLC)［1］，5年生存率僅為20%～25%，死亡原因主要是腫瘤的局部侵襲及遠處轉移。表皮生長因子受體(EGFR)是癌基因C-erbB-2產物的同源物，具有酪氨酸激酶的活性，其異常表達與腫瘤細胞的黏附、侵襲、轉移及凋亡抑制有關［2］;人類表皮生長因子受體2(HER-2)基因是重要的癌基因之一，其高表達與腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移和血管生成有關［3］。NSCLC組織中EGFR、HER-2蛋白表達的聯合檢測國內少見報道。本研究利用免疫組化方法檢測了EGFR、HER-2蛋白在NSCLC組織中的表達，分析了兩者間及與腫瘤臨床病理特征的關系，旨在為NSCLC的診治提供新思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 青島大學醫學院附屬醫院胸外科2011年10月～2012年10月收治的的NSCLC患者68例，男42例，女26例;年齡42～78歲(中位年齡62歲)，其中＜60歲35例、≥60歲33例;有吸煙史39例。均經病理檢查確診，其中腺癌48例，鱗癌20例;低分化27例，中高分化41例;TNM分期Ⅰ、Ⅱ期40例，Ⅲ期28例;有淋巴結轉移37例。患者術前均未接受過化療、放療及免疫治療。留取手術切除的腫瘤組織68份及癌旁正常肺組織(無癌細胞浸潤，距腫瘤病變＞5 cm)20份，10%甲醛中性緩沖液固定、石蠟包埋，4 μm厚連續切片。

1.2 試劑 鼠抗人 EGFR單克隆抗體、鼠抗人HER-2單克隆抗體及SP免疫組化試劑盒，均購自北京康為世紀生物科技有限公司，其余試劑為國產分析純。

1.3 EGFR及HER-2蛋白的檢測方法 取上述石蠟切片，行常規HE染色及免疫組化SP染色。①脫蠟水化:60℃烤片1 h，二甲苯脫蠟2次、每次5 min，依次浸入梯度乙醇和蒸餾水中各5 min水化。②抗原修復:將pH值為6.0的0.01 mol/L檸檬酸緩沖溶液加入高壓鍋內，修復切片完全浸于修復液中后蓋上壓力鍋蓋，加熱至均勻噴氣，1～2 min后壓力鍋離開熱源，自然冷卻至室溫，取出切片，蒸餾水淋洗，PBS漂洗2次、每次3 min。③封閉、染色:滴加試劑1(內源性過氧化物酶封閉液)，室溫孵育10 min，PBS充分淋洗;滴加試劑2(封閉用正常羊血清工作液)，室溫孵育10 min，甩干。分別滴加EGFR、HER-2一抗工作液(1∶100、1∶50)，室溫孵育 1 h，PBS 充分淋洗。滴加試劑3(生物素標記羊抗鼠二抗工作液)，室溫孵育10 min，PBS充分淋洗;滴加試劑4(HRP標記的鏈霉親和素)，室溫孵育10 min，PBS充分淋洗。滴加DAB顯色工作液顯色，顯色時間1～5 min，顯微鏡下觀察達最佳顯色效果后自來水沖洗;甩去自來水，滴加適量改良型蘇木素以覆蓋整個組織，復染30 s～3 min，自來水沖洗復染液，PBS或去離子水浸泡切片3～5 min，使胞核反藍;脫水、透明、封片、鏡檢。EGFR表達以細胞質和細胞膜呈棕黃色或棕褐色顆粒為陽性，HER-2表達以細胞膜呈棕褐色顆粒狀為陽性。著色強度判定標準:不著色為0分(陰性)，輕度著色為1分(弱陽性)，中度著色為2分(陽性)，強著色為3分(強陽性);陽性細胞率(計數10個高倍鏡視野)判定標準:＜5%為0分，5%～30%為1分，31%～70%為2分，＞70%為3分。兩積分相乘之積≥1判為表達陽性。

1.4 統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件進行數據處理和分析。率的比較采用 χ2檢驗;EGFR、HER-2蛋白表達及與腫瘤臨床病理參數的相關性采用Spearman相關分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EGFR、HER-2蛋白表達及與 NSCLC臨床病理參數的關系 NSCLC組織及癌旁組織中EGFR蛋白陽性表達者分別為37例(54.4%)、0例，HER-2蛋白陽性表達者分別為45例(66.1%)、0例，陽性率兩兩比較，P 均 ＜0.05(χ2分別為 18.78、27.08)。EGFR蛋白表達與NSCLC病理類型及有無淋巴結轉移有關，P 均 ＜0.05(χ2分別為 9.88、14.80);與NSCLC分化程度、TNM分期及患者年齡、性別、吸煙情況無明顯相關(P均 ＞0.05)。HER-2蛋白表達與NSCLC的TNM分期及有無淋巴結轉移有關，P 均 ＜0.05(χ2分別為 8.12、8.06);與NSCLC分化程度、病理類型及患者年齡、性別、吸煙情況無明顯相關(P均＞0.05)。詳見表1。

表1 EGFR、HER-2蛋白表達與NSCLC臨床病理參數的關系

2.2 EGFR與HER-2蛋白在NSCLC組織中表達的相關性 68例NSCLC組織中EGFR、HER-2蛋白均陽性表達32例、均陰性表達18例，EGFR蛋白陽性表達而HER-2蛋白陰性表達5例、EGFR蛋白陰性表達而HER-2蛋白陽性表達13例。EGFR、HER-2 蛋白的表達呈正相關，r為1.0(P ＜0.05)。

3 討論

近年來，我國NSCLC的發病率和病死率均有升高趨勢，治療方法主要包括手術、放療、化療、分子靶向治療等。其中針對NSCLC患者EGFR基因表達的分子靶向治療藥物(EGFR-TKI)如吉非替尼、厄洛替尼顯示了空前的優越性，多項研究證實對于EGFR突變陽性患者可予EGFR-TKI作為一線治療［4］。靶向藥物拉帕替尼是一種可逆性EGFR和HER-2雙受體阻斷劑，臨床試驗證明其對多種實體腫瘤有明顯的抑制作用［5］。因此，EGFR和HER-2作為分子靶標在 NSCLC治療中的作用日漸突出。EGFR是表皮生長因子受體家族成員之一，具有酪氨酸激酶活性的膜受體，能與相應配體如表皮生長因子(EGF)及TGF-α結合形成二聚體，激活酪氨酸激酶活性，使自身酪氨酸殘基發生磷酸化，并能與下游含PTB和SH2區域的蛋白結合激發激酶級聯反應，進而激活細胞信號傳導通路，調節并促進細胞分化、生長、遷移、黏附等。EGFR不但具有調節正常細胞增殖分化的作用，還是腫瘤細胞增殖、分化和抗凋亡過程中的重要調節因子，其異常表達可促進腫瘤細胞增殖、黏附、侵襲、轉移及誘導腫瘤新生血管形成［6，7］，與多種惡性腫瘤的發生、發展密切相關，且在30%～70%的NSCLC組織中過表達，尤其是非吸煙、女性、肺腺癌患者［8］。本研究顯示，EGFR蛋白在NSCLC組織中的陽性表達率明顯高于癌旁組織，且與NSCLC病理類型及淋巴結轉移情況有關。證實EGFR與NSCLC的發生、轉移有關。但本研究未發現EGFR蛋白表達與NSCLC分化程度、TNM分期及患者年齡、性別、吸煙情況有關，可能與樣本量小有關。HER-2癌基因與EGFR同屬于表皮生長因子家族，所編碼的跨膜糖蛋白是一種具有酪氨酸激酶活性的細胞膜受體，能與相應配體結合后形成同源性二聚體或異源性二聚體，并通過激活細胞內的酪氨酸磷酸化參與細胞的信號傳遞過程，信號在細胞內通過激酶級聯反應最終介導和調節細胞的生長、分化、增殖和黏附。正常情況下，HER-2原癌基因能與其他表皮生長因子受體結合，通過復雜的信號傳遞調節細胞的生長和分化;受到某些致癌因素的作用后，HER-2的蛋白結構或表達調控失常，可促使細胞發生惡性轉化，并通過阻止腫瘤細胞凋亡及促進腫瘤新血管生成等途徑促進腫瘤細胞的生長、浸潤及轉移［9，10］。研究［11］表明，HER-2 在人類許多腫瘤組織中有異常表達，與腫瘤細胞分化、增殖、轉移、侵襲等過程密切相關，而且還使細胞的惡性度增加。本研究結果顯示，HER-2蛋白在NSCLC組織中的陽性表達率明顯高于癌旁組織，且與NSCLC的TNM分期及淋巴結轉移情況有關。證實HER-2蛋白高表達與NSCLC的浸潤轉移及進展密切相關，有望成為評價肺癌轉移和判斷腫瘤進展的重要分子生物學指標之一。

EGFR參與正常的細胞生長、分化和修復，在無活性狀態下以每個HER單體的形式存在，與相應配體結合后促使其形成同源二聚體或異源二聚體。許多腫瘤發生與EGFR突變、過表達等導致的受體激活有關。EGFR和HER-2是生長因子家族中最活躍、最受矚目的受體，也是NSCLC組織中的主要合作受體，原因可能為激活的含有HER-2的異源二聚體復合物比含有其他HER家族成員的復合物在細胞表面更穩定、更具侵襲力［12］。Pidaparthi［13］采用多元分析技術發現，肺癌組織中EGFR/EGFR和EGFR/HER-2是最常見的二聚體形式。HER-2具有增強配體誘導的受體激活、增加并延長信號傳導通路、增強配體與受體的親和力、減少配體自同族的HER成員中分離的作用，且EGFR/HER-2與同源二聚體比較有更強的增殖、侵襲、轉移作用［14］。本研究顯示，NSCLC組織中EGFR、HER-2蛋白表達呈正相關。推測兩蛋白可能通過形成EGFR/HER-2異源二聚體參與NSCLC的發生和發展，且二者之間的相互作用具有導致腫瘤浸潤轉移的傾向。由于本研究的病例數量有限，且檢測方法、操作程序及評分標準有不足之處，上述結論尚有待于進一步研究證實。

綜上所述，EGFR、HER-2蛋白在NSCLC組織中呈高表達，兩者可能協同參與腫瘤發生、發展、侵襲及轉移。

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