莪術油對棕櫚酸誘導的腎小管上皮細胞脂毒性反應的抑制作用觀察

胡道榮，李 杰

（重慶市合川區人民醫院，重慶 401520）

慢性腎臟病（CKD）是各種原因引起的慢性腎臟結構和功能障礙。引起CKD的疾病主要包括各種原發性、繼發性腎小球腎炎、腎小管損傷和腎血管病變等。CKD往往伴有不同程度的脂質代謝紊亂，后者既是許多原發性或繼發性腎臟疾病的常見臨床表現，同時也參與了腎臟疾病的發生發展［1］。棕櫚酸是一種飽和高級游離脂肪酸，有研究表明一定濃度棕櫚酸對腎小管上皮細胞有損傷作用［2，3］。莪術油是我國傳統中藥，有活血化瘀之功效，現已廣泛應用于腎炎、脂肪肝等的治療中［4～7］。2013年3月～2014年5月，我們采用棕櫚酸誘導構建了人腎小管上皮細胞系HK-2脂毒性損傷模型，觀察了莪術油對腎小管上皮細胞的保護作用，現分析結果，探討其相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料 HK-2細胞（中科院上海細胞所），1640培養基和胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司），棕櫚酸（美國Sigma公司），莪術油注射液（浙江天瑞藥業有限公司），Trizol試劑（美國 Invitrogen公司），RNA反轉錄試劑盒（寶生物工程大連有限公司），p53上調凋亡調控因子（PUMA）、細胞死亡調節因子（Bim）單抗（美國Sigma公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養與處理 HK-2細胞用含10%胎牛血清的1640培養基培養。培養瓶放置于37℃、5%CO2培養箱中，細胞生長至鋪滿瓶底80%左右時消化、傳代。HK-2細胞接種于96孔板，將細胞分為對照組、棕櫚酸組和莪術油組。對照組不作處理，棕櫚酸組分別加入終濃度為0.2、0.8 mmol/L的棕櫚酸，莪術油組分別加入終濃度為0.2、0.8 mmol/L的棕櫚酸與20 mg/L的莪術油。每濃度設5個復孔，各組處理 24 h。根據文獻［2，3］，0.2 mmol/L 棕櫚酸作用的細胞用于脂質沉積情況觀察，0.8 mmol/L棕櫚酸作用的細胞用于細胞增殖檢測、相關基因及蛋白測定。

1.2.2 脂質沉積情況觀察 各組培養18 h后吸棄培養基，將細胞接種于爬片，中性甲醛后油紅O染色，顯微鏡下（200×）觀察及采集圖像。

1.2.3 細胞增殖檢測 各組培養24 h后，每孔加入濃度為5 mg/mL的MTT溶液20 μL，繼續培養4 h，吸棄培養基后每孔加入150 μL的二甲基亞砜。震蕩后酶標儀測490 nm波長處的OD值，各組OD值表示細胞相對增殖量。

1.2.4 TNF-α、p53基因測定 各組培養24 h后，用Trizol試劑提取細胞總RNA，反轉錄試劑盒轉成cDNA。用Real-time PCR法檢測TNF-α和p53的相對表 達量。TNF-α 上游序列為 5＇-GCAGGTCTACTTTGGGATCATTG-3＇，下游序列為 5＇-GCGTTTGGGAAGGTTGGA-3＇;上游序列為 5＇-TTGGATCCATGTTTTGCCAACTGGCC-3＇，下游序列為 5＇-TTGAATTCAGGCTCCCCT TTCTTGCG-3＇。

1.2.5 PUMA、Bim蛋白表達測定 各組培養24 h后，分別加入適量細胞裂解液于冰上裂解細胞提取總蛋白。碧云天BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。采用Western blot法檢測 PUMA、Bim蛋白，按試劑盒說明書操作，采用Quantity One軟件對條帶灰度進行分析，實驗重復3次，取均值。

1.3 統計學方法 采用SPSS 11.5統計軟件。各組數據用±s表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 脂質沉積情況 對照組細胞無明顯脂質沉積;棕櫚酸組與莪術油組細胞內均有明顯脂質沉積，但兩組差異不大。見圖1。

圖1 各組細胞脂質沉積情況

2.2 細胞增殖情況 對照組、棕櫚酸組與莪術油組OD 值分別為 1.02 ± 0.05、0.62 ± 0.04、0.79 ±0.03，其中對照組高于其他兩組，莪術油組高于棕櫚酸組（P均 ＜0.05）。

2.3 TNF-α、p53 mRNA 表達 對照組細胞 TNF-α、p53 mRNA相對表達量低于棕櫚酸組與莪術油組，莪術油組低于棕櫚酸組（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組TNF-α、p53 mRNA相對表達量比較（n=5，±s）

表1 各組TNF-α、p53 mRNA相對表達量比較（n=5，±s）

注:與對照組相比，*P ＜0.05;與棕櫚酸組相比，#P ＜0.05

組別 TNF-αmRNA p53 mRNA棕櫚酸組 1.64 ±0.07* 1.47 ±0.10*莪術油組 1.50 ±0.06# 1.30 ±0.05#對照組1.00 ±0.00 1.00 ±0.00

2.4 PUMA、Bim蛋白表達 與對照組相比，棕櫚酸組的PUMA表達水平明顯升高。與棕櫚酸組相比，莪術油組PUMA表達明顯降低（P＜0.05）。各組Bim蛋白表達無明顯差異。

表2 各組PUMA、Bim相對表達量比較（n=5，±s）

表2 各組PUMA、Bim相對表達量比較（n=5，±s）

注:與對照組相比，*P ＜0.05;與棕櫚酸組相比，#P ＜0.05

組別PUMA Bim棕櫚酸組 1.61 ±0.12*1.12 ±0.16莪術油組 1.34 ±0.08# 1.04 ±0.09對照組1.00 ±0.00 1.00 ±0.00

3 討論

近來研究認為，脂質代謝紊亂是CKD發生發展的關鍵環節，代謝綜合征狀態可引起機體腎臟內脂質沉積和腎損傷［1］。“脂質腎毒性學說”認為，體內長期保持高游離脂肪酸水平，可誘導腎小管上皮細胞凋亡及促使腎臟疾病的發生，同時腎臟損害又可導致脂質代謝紊亂，過量游離脂肪酸在腎臟內積聚，導致發病［8～10］。此外游離脂肪酸本身的細胞毒性可損傷腎小管上皮細胞質、線粒體及溶酶體膜，引起腎小管上皮細胞變性、壞死和炎癥細胞浸潤。棕櫚酸又稱軟脂酸，是一種飽和高級游離脂肪酸，以甘油酯的形式普遍存在于動植物油脂中，在自然界中分布很廣［11］。莪術油是從莪術中提取出來的揮發油，其主要成分為多種倍半萜類，包括莪術醇、莪術二醇、吉馬酮等，具有抗腫瘤、抗炎等功效，臨床應用廣泛［12，13］。

本研究體外培養了HK-2細胞，分別經棕櫚酸與莪術油處理，發現0.2 mmol/L的棕櫚酸可導致HK-2細胞脂質沉積，0.8 mmol/L的棕櫚酸可導致HK-2細胞生長受抑，這與機體游離脂肪酸水平增高引發腎小管上皮細胞損害的病理過程相符。本研究發現，莪術油組與棕櫚酸組油紅染色結果差異不大，表明莪術油預保護對于棕櫚酸誘導的細胞脂質沉積沒有明顯的抑制作用;但莪術油組細胞增殖情況好于棕櫚酸組，提示莪術油對于棕櫚酸誘導的細胞生長抑制有一定的保護作用。

為進一步明確莪術油的保護機制，我們觀察了三組TNF-α、p53 mRNA及PUMA、Bim蛋白的表達變化。TNF-α誘導腎小管上皮細胞凋亡效應的產生很大程度上來自于其對損傷基因iNOS表達的誘導［14，15］。iNOS 是介導免疫性腎損傷、腎小管上皮細胞凋亡的關鍵基因，其表達增高可引起多種細胞發生凋亡和壞死。BH3-only蛋白是bcl-2家族中具有凋亡啟動作用的亞家族，包括PUMA和與bcl-2相互作用的Bim等，PUMA與Bim通過與bc-2/bax相互作用啟動內源性凋亡途徑，導致細胞凋亡。本研究發現對照組細胞TNF-α、p53 mRNA、PUMA蛋白相對表達量低于棕櫚酸組與莪術油組，莪術油組低于棕櫚酸組，表明莪術油對腎小管上皮細胞的保護作用可能與調節BH3結構或下游通路有關。PUMA表達主要受p53調節，而Bim主要結合在微管動力蛋白上發揮促凋亡活性［11，12］

綜上所述，莪術油對棕櫚酸誘導的HK-2細胞的脂毒性損傷有一定保護作用，可改善細胞增殖抑制狀態，其機制可能與抑制 TNF-α、p53 mRNA及PUMA蛋白表達有關。

［1］萬克強，廖俊蕾，趙蕾，等.炎癥對脂肪酸負荷的腎細胞FAT/CD36表達的影響［J］.中國病理生理雜志，2012，28（2）:308-313.

［2］Joshi-Barve S，Barve SS，Amancherla K，et al.Palmitic acid induces production of proinflammatory cytokine interleukin-8 from hepatocytes［J］.Hepatology，2007，46（3）:823-830.

［3］Akazawa Y，Cazanave S，Mott JL，et al.Palmitoleate attenuates palmitate-induced Bim and PUMA up-regulation and hepatocyte lipoapoptosis［J］.J Hepatol，2010，52（4）:586-593.

［4］張靜，彭六保，劉俏，等.中藥某些活性成分治療慢性腎衰的藥理研究概況［J］.中南藥學，2011，9（9）:696-699.

［5］劉紅艷，彭安邦，廖愛軍，等.莪術油注射液對肝星狀細胞凋亡的影響［J］.中華肝病雜志，2009，17（10）:790-791.

［6］吳海霞，孫志明，王勤.莪術油的藥理學研究及臨床應用研究進展概況［J］.中國醫藥導刊，2011，13（1）:79-83.

［7］唐淵，李曉輝.莪術提取物對肝癌細胞系HepG2的抗癌作用及機制研究［J］.中國藥理學通報，2007，23（6）:790-794.

［8］Lupi R，Dotta F，Marselli L，et al.Prolonged exposure to free fatty acids has cytostatic and pro-apoptotic effects on human pancreatic islets:evidence that beta-cell death is caspase mediated，partially dependent on ceramide pathway，and Bcl-2 regulated［J］.Diabetes，2002，51（5）:1437-1442.

［9］左洋洋，付蕾，王文健，等.清道夫受體:脂質腎損傷的關鍵［J］.中華腎臟病雜志，2014.30（2）:155-158.

［10］Akazawa Y，Cazanave S，Mott JL，et al.Palmitoleate attenuates palmitate-induced Bim and PUMA up-regulation and hepatocyte lipoapoptosis［J］.J Hepatol，2010，52（4）:586-593.

［11］劉芳，劉凱，劉道潔，等.棕櫚酸對肝癌HepG2細胞自噬和凋亡的影響［J］.山東醫藥，2014，54（12）:8-10.

［12］梁莉萍，賈存東.莪術油對乳腺癌癌前病變大鼠的治療效果及作用機制［J］.中國老年學雜志.2013，33（12）:2821-2823.

［13］劉阿紅.復方莪術油栓治療陰道炎160例臨床觀察［J］.中國實用醫藥，2013，8（20）:187-188.

［14］劉亮明，孫水林，葉長根，等.Pim-3基因抑制暴發性腎小管上皮細胞凋亡的機制［J］.中華肝臟病雜志，2012，20（9）:688-692.

［15］袁航屠，世良何，徐軍.PUMA和BIM表達與結直腸癌浸潤轉移及預后的關系［J］.中華外科學雜志，2013，51（6）:547-551.