Osx基因活化技術(shù)促進種植體周圍骨再生的實驗研究

黃國倩，李大魯，李肇元

(濟南市口腔醫(yī)院，濟南250001)

經(jīng)典的組織工程骨由種子細胞、成骨因子和支架材料組成，通過填充骨缺損、發(fā)揮骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)作用來完成骨的修復(fù)與重建。但是體外組織工程骨的構(gòu)建步驟繁瑣，費用高，操作周期長，對患者損傷大;而且老年患者的骨髓間充質(zhì)干細胞占骨髓細胞的比例相應(yīng)減少，細胞增殖率下降且體內(nèi)成骨能力明顯減低;同時外源性成骨因子在體內(nèi)易流失和失去活性，作用持續(xù)時間短，效價低，成本高，可能會誘發(fā)機體免疫反應(yīng)。2010年6月～2011年3月，我們通過基因技術(shù)將編碼與骨組織再生相關(guān)的生長因子基因片段轉(zhuǎn)移至種子細胞中，使種子細胞持續(xù)高效表達促骨生長因子，促進骨的形成。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物:選用健康雄性12個月齡Beagle犬(山東省醫(yī)藥工業(yè)研究所提供，符合國際實驗動物要求)15只，體質(zhì)量9～12 kg。犬均采用籠中獨立圈養(yǎng)的方法，定時、定量攝食，自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后進行實驗。實驗過程中對動物處置符合2006年科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。主要藥品及器材設(shè)備:質(zhì)粒pcDNA3.1 flag-Osx、大腸桿菌 E.coli DH5α 感受態(tài)、Biogide可吸收性膠原骨膜。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒 pcDNA3.1flag-Osx的擴增 使用 Qiagen質(zhì)粒大提試劑盒從大腸桿菌E.coli DH5α中純化提取質(zhì)粒 pcDNA 3.1 flag-Osx。

1.2.2 動物實驗

1.2.2.1 術(shù)前準(zhǔn)備 制備Osx基因活化材料倍骼生+凍干質(zhì)粒，在無菌操作臺上將0.5 g倍骼生準(zhǔn)備好，使用凍干機24 h凍干質(zhì)粒備用，每個骨缺損處放置1.2 mg質(zhì)粒。

1.2.2.2 手術(shù)過程 實驗犬下肢外側(cè)區(qū)域備皮，局部消毒后行靜脈注射戊巴比妥鈉溶液麻醉(戊巴比妥鈉與0.9%氯化鈉注射液配成濃度為1%～3%的溶液)，麻醉注射劑量為30 mg/kg;待麻醉起效后，將實驗犬臥位固定于手術(shù)臺上，開口器固定。每只動物拔除左側(cè)下頜第2前磨牙(標(biāo)記為部位A)及右側(cè)下頜第2前磨牙(標(biāo)記為部位B)，在拔牙創(chuàng)周做梯形切口，翻瓣，用超聲骨刀于拔牙創(chuàng)頰側(cè)制備頰舌向5 mm、近遠中向5 mm、垂直高度10 mm的骨缺損，分別植入直徑3.3 mm、長度13 mm的奧齒泰 GSII種植體，A處骨缺損區(qū)填入倍骼生+空載體pcDNA3.1flag(為A組);B處骨缺損區(qū)填入倍骼生+pcDNA3.1flag-Osx(為 B組)。應(yīng)用GBR技術(shù)，在材料表面覆蓋Bio-gide膠原膜，嚴密縫合牙齦。

1.2.2.3 CT 掃描 分別于術(shù)后 4、8、12 周各處死5只動物，取含種植體近遠中向至少6 mm的下頜骨，包括頰舌側(cè)牙齦及軟組織，制備成約15 mm×6 mm×20 mm的組織塊。用生理鹽水沖洗標(biāo)本，固定于4%甲醛48 h。將標(biāo)本置于GE公司Explore Locus Micro-CT標(biāo)本檢測臺上并牢固固定，注意保持種植體長軸與掃描室切面垂直，沿標(biāo)本的長軸方向掃描，獲取連續(xù)的Micro-CT圖像。選定興趣區(qū)域(ROI)，CT值高于1 000定為骨組織。距離骨缺損上下緣2 mm，骨缺損左、右側(cè)1 mm處分別選定2 mm×1 mm×1 mm大小的組織2塊，記為ROI1、ROI2。進行掃描圖像的三維重建后，采用直接法和間接法計算評估。檢驗參數(shù)包括:骨小梁體積(BV)、骨體積分數(shù)(BVF)、骨小梁間隙(TbSp)、骨小梁厚度(TbTh)、骨小梁數(shù)目(TbN)、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(SMI)。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用 SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，組間比較進行配對t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物一般情況 術(shù)后各觀察時期內(nèi)實驗動物均健康存活，創(chuàng)口愈合良好，無炎癥反應(yīng)，經(jīng)術(shù)后3 d的抗生素肌注，術(shù)后1周炎癥反應(yīng)基本消退予以拆除縫線。術(shù)區(qū)無感染、無生物膜暴露、無軟組織裂開等并發(fā)癥。

2.2 兩組CT掃描數(shù)據(jù)比較 兩組術(shù)后4、8、12周TbSp、TbTh 、TbN、SMI、BVF、BV 比較見表 1。

表1 兩組術(shù)后 4、8、12 周 TbSp、TbTh 、TbN、SMI 、BVF、BV 比較(±s)

表1 兩組術(shù)后 4、8、12 周 TbSp、TbTh 、TbN、SMI 、BVF、BV 比較(±s)

注:與A組同時間比較，aP＜0.05

組別 n TbSp(μm) TbTh(μm) TbN(個/mm) SMI BVF(%) BV(mm3)A 組術(shù)后4 周 5 12.06 ±0.12 0.37 ±0.33 0.47 ±0.13 2.05 ±0.14 0.31 ±0.10 6.32 ±0.51術(shù)后8 周 5 12.81 ±0.16 0.40 ±0.43 0.50 ±0.12 1.39 ±0.02 0.37 ±0.02 7.95 ±0.38術(shù)后12 周 5 11.96 ±0.43 0.44 ±0.23 0.60 ±0.79 1.66 ±0.23 0.41 ±0.05 8.90 ±0.65 B組術(shù)后4 周 5 12.87 ±0.20a 0.39 ±0.02 0.49 ±0.19a 2.09 ±0.06 0.32 ±0.02a 7.21 ±0.05a術(shù)后8 周 5 12.34 ±0.12a 0.43 ±0.42a 0.55 ±0.29a 2.01 ±0.32 0.38 ±0.53 8.67 ±0.20a術(shù)后12 周 5 12.64 ±0.37a 0.46 ±0.20a 0.67 ±0.35a 1.69 ±0.21a 0.47 ±0.48 9.78 ±0.79a

3 討論

3.1 Osx基因及其表達和調(diào)控 Osx［1］是近年發(fā)現(xiàn)的成骨細胞分化和骨形成過程中所必需的轉(zhuǎn)錄因子，尤其在成骨細胞終末分化成熟過程中發(fā)揮重要作用。人Osx基因編碼產(chǎn)物為特異蛋白7(SP7)，是含有428個氨基酸的蛋白質(zhì)，羧基末端有3個連續(xù)的Cys2-His2鋅脂結(jié)構(gòu)，該鋅脂結(jié)構(gòu)可與真核細胞啟動子結(jié)合調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄［2］。Bowman 等［3］比較了Osx基因和其他SP家族成員序列后發(fā)現(xiàn)，Osx具有一個獨立的蛋白序列谷氨酸轉(zhuǎn)導(dǎo)活化區(qū)，而且在鋅脂結(jié)構(gòu)外有一個富含脯氨酸區(qū)域。脯氨酸富含區(qū)是BMP信號通路中重要的結(jié)合區(qū)，對成骨細胞的分化非常重要。有人認為Osx基因是核結(jié)合因子(Cbfal)的下游基因，Cbfal是成骨細胞分化最關(guān)鍵的作用因子。在Osx基因剔除小鼠胚胎中，成骨細胞的分化受到阻礙，各種成骨分化標(biāo)志的表達水平也嚴重降低或缺如。其中骨鈣素作為一種高度特異性的晚期成骨細胞標(biāo)志物的表達缺失，說明成骨細胞的分化、成熟被完全阻斷［4］。染色發(fā)現(xiàn)，Osx(-/-)小鼠胚胎中無礦化反應(yīng)、完全喪失骨形成能力，新生的Osx(-/-)小鼠出生后即因呼吸困難死去。由此可見，Osx是成骨細胞分化和骨發(fā)育不可缺少的調(diào)節(jié)因子［5，6］。

3.2 基因活化技術(shù) 基因治療本質(zhì)上是向細胞導(dǎo)入特異性的基因信號，合成和分泌一種基因產(chǎn)物(蛋白質(zhì))的過程［7］。干細胞在轉(zhuǎn)染成骨基因后，可以出現(xiàn)自分泌和旁分泌現(xiàn)象［8］。在這個過程中，細胞介導(dǎo)的生長因子合成與細胞本身的靶受體更加緊密地聯(lián)系在一起，增強了機體對基因治療的反應(yīng)強度和持續(xù)性［9］。加上轉(zhuǎn)染的修飾作用，基因轉(zhuǎn)染的干細胞所分泌的生長因子可能具有更高的生物學(xué)活性。基因活化材料是專為組織工程設(shè)計的轉(zhuǎn)基因材料。基因活化技術(shù)是一種直接的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，也可以看成是組織工程概念的延伸。一個基因活化材料包含一個三維的轉(zhuǎn)基因載體和生物可降解結(jié)構(gòu)基質(zhì)［10］，載體作為一種保存原位 DNA的支架持續(xù)發(fā)揮作用至內(nèi)源性的修復(fù)細胞到達。與載體聯(lián)合的攜帶編碼細胞因子和生長因子基因的DNA會表達所需要起治療作用的基因。當(dāng)基因活化材料植入組織缺損區(qū)時，其中的DNA隨著材料的溶脹、降解而釋放出來，材料內(nèi)的種子細胞或周邊組織細胞與釋放出來的基因成分結(jié)合，或黏附在材料表面，通過內(nèi)吞方式獲取治療基因片段，表達、合成治療因子并作用于周圍細胞。這樣即可持續(xù)的使細胞因子少量表達，引起局部修復(fù)應(yīng)答，以實現(xiàn)組織再生。

基因活化基質(zhì)采用體內(nèi)被動方式轉(zhuǎn)染基因，操作簡單，能節(jié)約費用和減少對患者的損傷，在促進局部組織尤其是骨組織損傷修復(fù)方面有明顯的優(yōu)勢。種植體周圍骨缺損的修復(fù)是一個長期的過程，生長因子在局部長期表達有利于骨的重建，而且質(zhì)粒DNA在血液中的高分解率使其不會造成全身中毒。這種直接將基因傳遞到靶細胞的方法在臨床應(yīng)用的可能性很大，因此我們采用基因活化材料來修復(fù)犬種植體周圍的骨缺損，并觀察其療效。通過CT檢查發(fā)現(xiàn)［11］，本研究中Osx植入種植體頰側(cè)骨缺損處的A組與無Osx植入的B組比較，TbSp、TbN、BVF、BV均有統(tǒng)計學(xué)差異。顯示應(yīng)用Osx基因激活基質(zhì)可有效促進種植體頰側(cè)骨缺損處新骨的形成。目前應(yīng)用基因治療促進種植體周圍新骨形成的研究尚少，本實驗結(jié)果可以為進一步研究Osx基因在臨床的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

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