GATA-6蛋白在喉鱗狀細胞癌組織中的表達及意義

岳文慧，張立廣，于鐵莉，陸鴻略，梁 媛，張淑君，趙瑞力

(1承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院，河北承德067000;2河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院)

喉癌是頭頸部常見惡性腫瘤之一，90%以上為鱗狀細胞癌。GATA-6是GATA家族成員之一，具有高度保守的鋅指結構，能夠通過識別GATA序列并與之結合，啟動報告基因轉錄。已有研究表明，在一些腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中GATA-6具有抑制腫瘤細胞凋亡，促進腫瘤細胞侵襲、轉移的作用。本研究采用免疫組織化學方法檢測喉鱗狀細胞癌組織中GATA-6蛋白的表達情況，探討GATA-6蛋白的表達與喉癌發(fā)生、發(fā)展之間的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2008年1月～2012年4月承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科住院手術治療的48例喉癌患者手術切除癌組織(喉癌組)，患者術前均未行放、化療及免疫治療。男45例、女3例，年齡為44～78歲;伴有淋巴結轉移17例，無淋巴結轉移31例(根據(jù)術后病理決定有無淋巴結轉移);喉癌分型:聲門上型16例，聲門型32例;腫瘤長徑＜3 cm 20例，≥3 cm 28例;病理學分級:高分化鱗癌15例，中分化鱗癌20例，低分化鱗癌13例;臨床分期采用2002年UICC TNM分類分期標準，臨床Ⅰ期6例，Ⅱ期10例，Ⅲ期22例，Ⅳ期10例。吸煙量(每天量×年×365)≤20萬支者11例，＞20萬支者37例。另收集20例非喉癌患者的喉部正常黏膜組織作為對照，其性別、年齡與喉癌組比較差異無統(tǒng)計學意義。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法 新鮮組織均在取材離體后馬上放入10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制成5 μm厚切片。主要試劑為GATA-6兔抗人多克隆抗體(sc-9055)，來源于美國Santa Cruz公司;即用型快捷免疫組化Max Vision試劑盒為福州邁新生物技術有限公司產品;即用型DAB顯色試劑盒來源于北京四正柏生物科技有限公司。采用免疫組織化學法，實驗步驟嚴格按照實驗說明書進行。每批實驗均參照美國Santa Cruz公司提供的陽性對照片，以PBS代替一抗作陰性對照。一抗稀釋比例為1∶100。

1.2.2 結果判定 分別由3名有經(jīng)驗的病理科醫(yī)生獨立閱片，根據(jù)其評分的平均值采用Volm雙評分法進行判定。①按陽性細胞百分率評分:光鏡10×20倍下，隨機選擇5個染色均勻視野，陽性細胞百分率≤25%為1分，陽性細胞百分率26%～50%為2分，陽性細胞百分率＞50%為3分;②按染色強度評分:無顯色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將上述兩項得分相加:0～2分判為+，3～4分判為++，5～6分判為 +++。++和+++為陽性表達，+為陰性表達。

1.2.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 GATA-6蛋白在喉癌組織的表達情況 GA-TA-6蛋白陽性染色定位于細胞核，陽性表達呈棕黃色顆粒狀。GATA-6蛋白在喉癌組織及正常喉部黏膜中均有表達，在喉癌組織中的陽性表達率明顯高于正常喉部黏膜組織(75.00%vs 35.00%，P＜0.05)。

2.2 GATA-6蛋白表達與喉癌臨床病理因素的關系 GATA-6蛋白在喉癌組織中的表達與淋巴結轉移、臨床分期、病理分級有關(P均＜0.05)，與臨床分型、腫瘤大小、吸煙量、年齡和性別無關。見表1。

表1 GATA-6蛋白表達與臨床病理因素的關系

3 討論

GATA家族共有6個成員，分為兩類，GATA-1/-2/-3和GATA-4/-5/-6，它們有完全不同且又相互重疊的作用模式。每一個GATA轉錄因子的DNA結合域均含有2個相似的Ⅳ型鋅指結構，羧基端的鋅指結構是結合DNA的主要結構，氨基端的鋅指結構與結合穩(wěn)定性和特異性相關［1］。GATA家族在人體的各種生理病理過程中的作用已成為當今研究的熱點，其中GATA-6蛋白由Tamura等［2］首次在兔的胃組織中發(fā)現(xiàn)。人類GATA-6基因編碼595個氨基酸，在來源于中胚層和內胚層的各種不同組織中表達，調節(jié)胃腸、心臟和性腺等多個器官的正常發(fā)育和功能形成［3］。

Zhong等［4］研究發(fā)現(xiàn)GATA-6作為癌基因在胰腺導管癌中呈高表達，尤其在晚期腫瘤中表達更為明顯，其通過激活Wnt信號通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。Adachi等［5］研究發(fā)現(xiàn)，致癌通路Ras/Raf/MEK/ERK中Nox 1與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關，而 GATA-6蛋白的磷酸化，可能是維持這一通路持續(xù)上調的原因之一。Shureiqi等［6］研究表明，GATA-6蛋白通過與組蛋白去乙?；赶嗷f(xié)同作用，進而抑制15-脂氧合酶-1的表達，降低了過氧化物酶增殖體對受體的激活，從而發(fā)揮抑制結腸癌細胞凋亡的作用。Gorshkova等［7］在小鼠肺癌基因K-RAS的12號密碼子外顯子上發(fā)現(xiàn)存在可與GATA-6相結合的位點。同時發(fā)現(xiàn)，給肺癌非易感性小鼠C57BL注射致癌物3-MC，DNA與GATA-6的結合活性無明顯變化。而給肺癌易感性小鼠ICR注射致癌物3-MC后，DNA與GATA-6的結合活性明顯增強，表明GATA-6蛋白與肺癌的發(fā)生有關。Belaguli等［8］發(fā)現(xiàn)，在結腸癌中 GATA-6蛋白可正向調控尿激酶型纖溶酶原激活物的基因表達，增強結腸癌腫瘤細胞的侵襲性。本研究發(fā)現(xiàn)GATA-6在喉癌組織中的陽性表達率明顯高于正常喉部黏膜組織，有淋巴結轉移者高于無淋巴結轉移者，Ⅲ～Ⅳ期者高于Ⅰ～Ⅱ期，低分化者高于高分化者和中分化者。提示GATA-6作為癌基因誘導喉癌細胞生長，隨著GATA-6蛋白表達的增強，喉癌細胞侵襲性和轉移能力明顯增強，表明GATA-6在喉癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起一定的作用，這可能與一些相關的抑癌基因作用被抑制，致癌通路的異常激活及腫瘤轉移因子作用增強有關。

總之，喉癌組織中GATA-6蛋白高表達，通過測定GATA-6蛋白的表達量及研究其與臨床病理特征之間的關系，進一步深入了解相關調節(jié)機制，有望為喉癌診斷、治療技術的進一步發(fā)展奠定理論基礎。

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［4］Zhong Y，Wang Z，F(xiàn)u B，et al.GATA-6 activates Wnt signaling in pancreatic cancer by negatively regulating the Wnt antagonist Dickkopf-1［J］.PloS One，2011，6(7):e22129.

［5］Adachi Y，Shibai Y，Mitsushita J，et al.Oncogenic Ras upregulates NADPH oxidase 1 gene expression through MEK-ERK-dependent phosphoryl ation of GATA-6 ［J］.Oncogene，2008，27(36):4921-4932.

［6］Shureiqi I，Zuo X，Broaddus R，et al.The transcription factor GATA-6 is overexpressed in vivo and contributes to silencing 15-LOX-1 in vitro in human colon cancer［J］.FASEB J，2007，21(3):743-753.

［7］Gorshkova EV，Kaledin VI，Kobzev VF，et al.Codon 12 region of mouse K-ras gene is the site for invitro binding of transcription factors GATA-6 and NF-Y ［J］.Biochemistry(Mosc)，2005，70:1180-1184.

［8］Belaguli NS，Aftab M，Rigi M，et al.GATA-6 promotes colon cancer cell invasion by regulating urokinase plasminogen activator gene expression［J］.Neoplasia，2010，12(11):856-865.