膿毒癥大鼠肝臟組織中免疫相關基因表達的改變

毛瑩瑩，王東強，李志軍

(1天津醫科大學第一臨床學院，天津300070;2天津市第一中心醫院)

膿毒癥屬于多基因疾病，可通過一系列復雜且逐級放大的全身炎癥反應造成機體重要臟器的損傷，其中肝臟是膿毒癥時最易受損的器官之一［1］。傳統的檢測方法不僅費時、費力，而且很難明確多基因的表達變化及其相互作用關系，而應用基因芯片技術則彌補了上述不足，為探討膿毒癥的分子機制提供了強有力的工具。基因芯片是將許多特定的基因片段作為探針有規律地排列于固相載體上，將合成aRNA經熒光標記后與其雜交，以計算機系統對雜交信號進行檢測分析，從而同時反映上千個基因的表達狀況［2］。2013年10月～2014年5月，我們通過盲腸結扎穿孔術(CLP)復制膿毒癥大鼠模型，采用基因芯片技術通過大量寡核苷酸探針大規模地檢測樣品的基因序列及表達信息，從基因水平揭示膿毒癥的發病機制，為尋求新的治療手段提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 Wistar大鼠，雄性，120只，清潔級，8～10周齡，體質量(250±10)g，由中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所動物實驗中心統一提供，并適應性飼養1周。5%的水合氯醛。分析天平(Mettler AE240)，超純水系統(Millipore Milli-Q)，小動物手術床(Py2-501213)，18 G穿刺針，注射器，皮針，4-0非吸收性外科縫線。美國Affymetrix大鼠全基因表達譜芯片(Rat Genome 230 2.0)，含有28 000個大鼠基因cDNA克隆，由天津生物芯片技術有限責任公司提供。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模 將120只大鼠隨機分為假手術組30只、模型組90只，假手術組和模型組根據不同時間點(24、48、72 h)再隨機分為3個亞組，每個亞組分別為10、30只。實驗前禁食過夜，自由飲水。按照改良 CLP［3～5］復制嚴重腹腔感染致膿毒癥模型。假手術組開腹翻動盲腸后關腹。觀察各組大鼠的一般狀況。

1.2.2 基因芯片的檢測 兩組分別于造模后24、48、72 h，無菌條件下取各亞組存活大鼠肝臟組織，速置于液氮中，-70℃保存待檢。采用大鼠全基因表達譜芯片檢測兩組肝組織中的差異表達基因，并對這些基因按其所編碼的蛋白質功能予以聚類分析。操作流程:①總RNA的提取和純化:用Trizol試劑盒抽提液氮中肝組織總RNA，紫外吸收測定法和變性膠電泳法確認RNA純度及完整性。②反轉錄并標記探針:利用T7-(dT)24作為引物，在反轉錄酶的作用下，由RNA反轉錄成單鏈cDNA，再以所合成的單鏈cDNA為模板，RNA片段為引物，在DNA聚合酶的作用下合成雙鏈DNA，并兩端補平。利用反轉錄過程中所加入的T7啟動子，在體系中加入T7轉錄酶進行轉錄擴增，并同時對產生的aRNA產物進行Biotin標記。③芯片雜交:與Rat Genome 230 2.0芯片雜交。④洗脫芯片:在洗滌工作站FS450上按照芯片類型，運行洗脫程序，對芯片進行清洗、染色和信號放大過程。⑤掃描芯片:用Scanner 3000 7G 4C掃描儀上芯片對芯片進行掃描和信號值轉換(將探針信號比的值做以2為底的對數轉換，正值為上調，負值為下調)。⑥差異基因的篩選:模型組/對照組倍數變化大于2或小于-2可認為基因的表達存在差異，且絕對值越大，基因表達差異越明顯。正值代表基因表達上調，負值代表基因表達下調。

2 結果

2.1 兩組一般狀況觀察 假手術組大鼠術后30 min左右完全蘇醒，因腹部疼痛而活動減少，不時舔舐傷口，但數小時后明顯好轉，飲食飲水正常。模型組術后24 h內，部分死亡，存活者軀體蜷縮，呼吸頻率較快，精神萎靡，眼目不睜，不進食水，對刺激反應遲鈍;24 h后精神狀態較前好轉，有少量活動，少量進食飲水。隨著時間的延長，多數大鼠眼周出現血性分泌物，排泄稀水樣便，色黃、味腥臭，多數病情進一步發展，皮膚松弛，肛溫低，排泄物呈黏液狀、量多，出現上述癥狀后短時間內死亡;另有少數大鼠出現腹瀉后又停止，進食、飲水量逐漸增加，活動逐漸增多。

2.2 兩組肝臟組織中基因表達譜差異 造模24 h，篩選出差異基因671條，免疫相關基因97條(表達上調48條、下調49條);造模48 h，篩選出差異基因133條，免疫相關基因36條(表達上調13條、下調23條);造模72 h，篩選出差異基因204條，免疫相關基因33條(表達上調18條、下調15條)。3個時間點重復基因共58條，免疫相關基因15條(表達上調4條、下調10條、先上調后上調1條)。兩組差異表達的部分免疫相關基因，見表1。

3 討論

CLP模型是研究膿毒癥較理想的模型，被認為是進行膿毒癥研究的金標準［6～7］。它是由盲腸結扎加穿孔致嚴重腹膜炎，動物能存活5～10 d，保持了感染源的持續存在，通過少量持續的細菌及腸內容物釋放，保證了促炎/抗炎反應的充分發展，形成了符合高代謝、高排低阻和全身炎癥反應等臨床癥狀的膿毒癥模型。本實驗中觀察到術后動物活動減少，被毛蓬松少光澤，排泄稀水樣便、色黃、味腥臭，膿尿，眼周出現血性分泌，瀕死前可出現呼吸困難，對被動仰臥無反抗等;尸解見腹腔有渾濁滲出液，空腔充氣甚至壞疽，盲腸腫脹、粘連，穿刺部位引流條明顯，肝、腎充血等。CLP模型制備較成功。

本實驗發現，在膿毒癥大鼠肝組織中，一系列與細胞防御及免疫功能相關的基因表達出現顯著改變，它們可能在不同程度上參與了膿毒癥大鼠肝損傷的病理生理過程。本實驗結果顯示，膿毒癥時脂多糖結合蛋白(LBP)基因表達上調。其表達產物屬脂質結合血清糖蛋白家族，主要功能是識別及結合LPS的脂質A基團，并與細胞膜上或血清中的CD14分子形成復合物，通過跨膜的共刺激分子Toll樣受體(TLRs)和細胞內的MAPK蛋白激酶信息傳導途徑，激活轉錄因子NF-κB等，啟動炎性和免疫反應相關基因的轉錄［8～11］。增加的 LBP可使細胞對LPS或革蘭陰性細菌的敏感性升高，進而增強免疫和炎性反應。另外，本實驗中IL-1受體拮抗劑(IL-1RN)表達上調。IL-1是在炎癥因子的刺激下所誘導產生的，它主要介導一系列炎癥和免疫反應中(IL-1可激活T、B淋巴細胞)所發生的病理、生理學反應。IL-1RN可與IL-1競爭性結合而抑制IL-1的生物活性。IL-1及其受體在體內的動態平衡是維持IL-1正常功能的關鍵。IL-1RN的高低可反映IL-1在膿毒癥中的致病作用，其表達上調則抑制IL-1的生物活性，在一定程度上可抑制IL-1對T、B淋巴細胞的激活作用，抑制機體的免疫功能。

表1 兩組差異表達的部分免疫相關基因

本研究發現，免疫系統重要調節細胞T細胞功能失調。膿毒癥狀態下，淋巴細胞大量凋亡所致淋巴細胞數目減少是造成機體免疫抑制狀態的重要原因，表現為非成熟及成熟淋巴細胞出現凋亡。雖然淋巴細胞對外界刺激異常敏感是細胞自身的一種保護機制，但是未成熟T細胞大量凋亡勢必引起釋放至外周淋巴器官中的成熟淋巴細胞減少，直接和間接損害免疫功能，最終將導致免疫低下狀態，該效應以T細胞功能抑制尤為突出。這與李志軍等［12］的研究一致。本實驗中，膿毒癥時S100A8基因表達升高。其表達產物屬S100小分子量蛋白家族，主要功能是與鈣離子結合，可與多不飽和脂肪酸如花生四烯酸等炎癥介質結合，并將其轉運至胞外，加劇炎癥反應［13］;該反應過程中TNF-α或IL-1又可使S100A8基因高表達，對膿毒癥的發展可能起到正反饋作用［1］。

本實驗中，模型組α2M表達顯著升高。α2M是一種蛋白酶抑制劑，能結合并清除某些過度表達的細胞因子［13］。膿毒癥時α2M升高，當過度產生的炎癥因子回落近平衡狀態且局部微環境穩定時，α2M反射性下調［14］。α2M表達升高為機體的一種自我保護機制。另外，膿毒癥發生時，內皮細胞、上皮細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞等產生大量促炎介質，如 IL-6、TNF-α、IFN-γ、HMGB1 等［15］，導致免疫平衡受到破壞。各種毒素侵襲使得淋巴細胞發生大量凋亡，免疫系統被廣泛抑制，導致病原菌不能及時被清除，感染進一步惡化。本實驗以基因芯片技術檢測到CLP膿毒癥的肝組織中免疫球蛋白重鏈表達量、聚合體的免疫球蛋白受體表達均下降，細胞免疫相關基因下調，炎癥趨化因子及抗炎相關基因上調，它們可能在膿毒癥及肝損傷的發病中起了一定的作用。

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