洛伐他汀對醛固酮誘導鼠心肌成纖維細胞增殖及其iNOS-NO系統活性的調控作用

馮惠平，賈新未，王艷飛，張 芳，張蘭芳，解俊敏

(河北大學附屬醫院，河北保定071000)

心肌成纖維細胞(CFs)增殖在心肌纖維化中起重要作用。已有報道CFs具有誘導型一氧化氮合酶—一氧化氮(iNOS-NO)系統，其合成的NO是一種重要的抗心肌纖維化因子［1］。我們的研究已證實醛固酮可下調CFs的iNOS-NO系統活性，與醛固酮促CFs增殖密切相關［2］。但他汀類藥物對醛固酮誘導的CFs的iNOS-NO系統活性是否有調控作用，及其與他汀類藥物拮抗醛固酮促CFs增殖的作用有無聯系鮮見報道。我們觀察了洛伐他汀干預條件下醛固酮誘導大鼠CFs的iNOS-NO系統活性的變化，旨在為心肌纖維化的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 出生2～3 d的SD大鼠18只，雌性10只，雄性8只，購于河北醫科大學動物中心。

1.1.2 試劑 洛伐他汀、醛固酮、四氮唑鹽(MTT)、胰蛋白酶購于Sigma公司;DMEM培養基購于美國Gibco公司;胎牛血清購于天津TBD公司;TRIzol試劑購于美國Invitrogen公司;PT-PCR試劑盒購于華美公司;iNOS mRNA和GAPDH mRNA的寡聚核苷酸引物由上海生物工程公司合成。NO和iNOS測定試劑盒為南京建成生物技術公司產品。波形蛋白單克隆抗體、纖維連接蛋白單克隆抗體、α肌動蛋白單克隆抗體、SABC試劑盒為武漢博士德公司產品。

1.2 方法

1.2.1 CFs的培養和鑒定 在無菌條件下取出SD大鼠的心室，采用胰酶消化法和差速貼壁法分離CFs［3］。待CFs生長接近融合時以1∶3傳代。采用SABC法對CFs行免疫組化染色，波形蛋白、纖維連接蛋白染色陽性和平滑肌肌動蛋白染色陰性鑒定為所需的CFs，純度達98%。實驗用2～3代細胞。

1.2.2 細胞分組 分為對照組、1×10-5mol/L洛伐他汀組(A組)、1×10-7mol/L醛固酮組(B組)、1×10-7mol/L醛固酮+1×10-8mol/L洛伐他汀組(C組)、1×10-7mol/L醛固酮+1×10-7mol/L洛伐他汀組(D組)、1×10-7mol/L醛固酮+1×10-6mol/L洛伐他汀組(E組)、1×10-7mol/L醛固酮+1×10-5mol/L洛伐他汀組(F組)、1×10-7mol/L醛固酮+1×10-5mol/L洛伐他汀+1×10-5mol/L甲羥戊酸(MVA)組(G組)、1×10-7mol/L醛固酮+1×10-5mol/L洛伐他汀+1×10-4mol/L MVA組(H組)、1×10-7mol/L醛固酮+1×10-5mol/L洛伐他汀+1×10-3mol/L MVA 組(I組)、1×10-7mol/L醛固酮+1×10-5mol/L洛伐他汀+5 μmol/L法尼酯焦磷酸(FPP)組(J組)。細胞取自同批培養的CFs。

1.2.3 各組細胞增殖情況觀察 采用MTT比色法。將對數生長期CFs接種在96孔板中，每孔5×103個細胞，在37℃、5%CO2及飽和濕度下培養;24 h后換含1%血清DMEM培養液，繼續孵育24 h，使細胞進入生長靜止期。棄上清液，對照組加入10%血清DMEM培養液，上述其他各組分別加入相應藥物繼續培養48 h，每組設6個復孔。于培養結束前4 h，加入 MTT(5 g/L)20 μL，在酶標儀上 490 nm 波長處測定吸光度值(A490值)。

1.2.4 各組細胞iNOS-NO系統活性測定 CFs培養至近融合狀態時，1%血清DMEM培養液馴化24 h，分別加入10%血清DMEM培養液和藥物，孵育24 h，收集細胞培養液。采用硝酸還原酶法檢測細胞培養液中的NO含量，具體操作按說明書進行。與NO含量測定同法處理細胞，通過iNOS催化產生的NO量推算iNOS的活力，采用分光光度計法測定吸光度值。iNOS活性以每毫升培養液每分鐘生成的1 nmol的NO為一個酶活力單位。公式:iNOS活性=(測定管吸光度 -空白管吸光度)×45.43 U/mL。具體操作按說明書進行。

1.2.5 各組細胞iNOS mRNA檢測 采用RT-PCR法。將2～3代的心室成纖維細胞種植于50 mL培養瓶中生長至亞融合狀態后，在含1%胎牛血清DMEM培養液中培養24 h，然后在10%血清DMEM培養液狀態下，加入相應藥物作用24 h后觀察iNOS mRNA的表達。①RNA抽提及測定:TRIzol試劑盒一步法抽提細胞總RNA。引物由上海生物工程公司合成。鼠iNOS cDNA(276 bp):上游引物5'-TCGAGCCCTGGAAGACCCACATCT-3'，下游引物 5'-GTTGTTCTTCTTCCAAGGTGTTTGCCTTAT-3';GAPDH cDNA(453 bp):上游引物5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。② RT-PCR:取總 RNA 2 μg，采用 TitanTM一步法RT-PCR試劑盒逆轉錄聚合酶鏈式反應，總反應體積為30 μL。混勻后，在熱循環儀上進行PCR反應，條件如下:95℃孵育5 min，然后分別94 ℃、1 min，55 ℃、1 min，72 ℃、1.5 min，共30 個循環。③產物分析:擴增產物行2%瓊脂糖凝膠電泳(含0.5 mg/L溴乙錠)，膠片經光密度掃描，測定各條帶吸光度值，以GAPDH作內參照，計算相對比值。

1.2.6 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗;多組均數比較采用方差分析和兩兩比較;兩組數據相關性采用直線相關分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組CFs增殖情況比較 對照組 A490值為0.208 ±0.019、A 組 0.209 ± 0.017、B 組 0.390 ±0.010、C 組 0.378 ±0.012、D 組0.356 ±0.011、E 組0.287 ± 0.008、F 組 0.231 ± 0.007、G 組 0.254 ±0.016、H 組0.339 ±0.014、I組 0.392 ±0.013、J組0.385 ±0.011。B 組與對照組比較，P ＜0.05，且與D、E、F 組比較，P 均 ＜0.01;G、H、I、J組與 F 組比較P ＜0.05 或 ＜0.01。

2.2 各組CFs的NO和iNOS活性比較 見表1。

表1 各組CFs的NO含量和iNOS活性比較(±s)

表1 各組CFs的NO含量和iNOS活性比較(±s)

注:與對照組比較，aP ＜0.01;與 B 組比較，cP ＜0.05，bP ＜0.01;與 C 組比較，dP ＜0.01;與 D 組比較，eP ＜0.05，fP ＜0.01;與F 組比較，gP ＜0.05，hP ＜0.01

組別 NO(μmol/L) iNOS活性(U/mL)29.43 ±3.26 5.54 ±0.67 B 組 16.62 ±1.28a 3.08 ±0.75a C 組 19.96 ±1.92b 3.99 ±0.63c D 組 25.46 ±1.74bd 4.62 ±0.62bd E 組 28.91 ±2.13bde 5.41 ±0.97bde F 組 35.56 ±1.92bdf 6.62 ±0.81bdf G 組 32.06 ±1.95g 5.40 ±0.76g H 組 21.82 ±1.75h 4.12 ±0.61h I組 16.65 ±1.44h 3.35 ±0.74h J組 17.45 ±1.56h 3.17 ±0.64對照組h

2.3 各組CFs iNOS mRNA表達水平比較 B、C、D、E、F組 CFs iNOS mRNA相對比值分別為0.297±0.008、0.374 ± 0.032、0.594 ± 0.023、0.776 ±0.063、1.027 ± 0.030，隨洛伐他汀濃度升高，iNOS mRNA表達量逐漸升高，呈劑量依賴性(P均 ＜0.05)。見圖1。G、H、I、J組 CFs iNOS mRNA 相對比值分別為0.804 ±0.085、0.556 ±0.035、0.309 ±0.014、0.313 ±0.017，與 F 組比較，P 均 ＜0.05，隨著MVA刺激濃度的增高，iNOS mRNA亦逐漸降低(P 均 ＜0.05)。1 ×10-3mo1/L MVA 和 5 μmol/L FPP可逆轉10-5mol/L洛伐他汀上調CFs iNOS mRNA水平的作用。

圖1 洛伐他汀對醛固酮誘導CFs iNOS mRNA表達的影響

圖2 MVA和FPP對洛伐他汀上調CFs的iNOS mRNA表達的影響

2.4 NO與 iNOS、iNOS與 iNOS mRNA及NO與細胞增殖的相關性 洛伐他汀干預下醛固酮誘導CFs的NO生成量與iNOS活性、iNOS活性與iNOS mRNA 表達均呈正相關(r分別為0.826、0.752，P 均 ＜0.01);NO 生成量與 A490值呈負相關(r=-0.908，P＜0.01)。

3 討論

CFs是心肌纖維化的主要效應細胞，其增殖和膠原合成積聚過多是心肌纖維化的主要病理基礎［4～6］。CFs合成的NO是一種重要的抗心肌纖維化因子，NO可通過自分泌和(或)旁分泌的途徑抑制CFs增生和膠原合成，NO能夠降低體外培養CFs纖維連接蛋白，Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA表達和纖維連接蛋白合成，延緩心肌纖維化發展［6］。本研究表明，CFs具有內源性iNOS-NO系統，能夠生成NO，與Gustafsson 等［1］研究結果一致。

他汀類藥物的非降脂作用日益受到矚目，除良好的調節脂代謝作用以外，他汀類藥物尚具有改善血管內皮細胞功能、抑制血管平滑肌細胞增殖，穩定斑塊，減少心肌梗死和腦卒中等心腦血管事件的發生。最近有研究［7］表明，氟伐他汀能減緩糖尿病大鼠心肌肥厚和心肌間質纖維化，并伴有心臟收縮和舒張功能的改善;瑞舒伐他汀能減緩并抑制狗的心肌肥厚，改善左室功能［8］。他汀類藥物延緩心肌纖維化的研究已成為新的研究熱點［9］，但其作用機制尚不清楚。我們的研究已證實他汀類藥物可抑制醛固酮促CFs增殖的作用，文獻［10，11］報道他汀可誘導血管內皮細胞的eNOS，增加NO的合成，我們的研究結果同樣表明在1×10-8～1×10-5mol/L濃度范圍內，洛伐他汀可抑制醛固酮作用增加CFs的NO含量、iNOS活性、iNOS mRNA表達，且呈劑量依賴性。

CFs的iNOS-NO系統中的多個因素是相互聯系，密不可分的。相關性分析表明，在洛伐他汀作用下，CFs的NO生成量的增加與iNOS活性增加呈正相關，iNOS活性的增加與iNOS mRNA表達量的增加呈正相關。洛伐他汀增加CFs的NO生成量和iNOS活性的同時，CFs的iNOS mRNA表達亦顯著增加，表明洛伐他汀在基因轉錄水平調控CFs的iNOS-NO系統活性。

本研究還發現，MVA、FPP呈濃度依賴性拮抗洛伐他汀增加CFs NO含量、iNOS活性和iNOS mRNA表達的作用。當加入1×10-3mol/L MVA或5 μmol/L FPP時，洛伐他汀對CFs增殖的抑制作用能被完全地逆轉的同時，洛伐他汀對CFs的NO含量、iNOS活性和iNOS mRNA表達的增加作用亦被逆轉，說明MVA和其代謝產物FPP在CFs的iNOSNO系統的活性調節中有重要作用。這與文獻［12～15］報道他汀類藥物在體外心肌細胞NO釋放能被外源加入的MVA所阻斷相一致。進一步支持MVA途徑可能參與洛伐他汀上調醛固酮誘導CFs的iNOS-NO系統活性。洛伐他汀上調CFs的iNOSNO系統的活性可能是其抑制CFs增殖的作用機制之一。醛固酮誘導的CFs的iNOS-NO系統活性降低，導致CFs增殖，促心肌纖維化的形成。而洛伐他汀可上調醛固酮誘導的CFs的iNOS-NO系統的活性，拮抗醛固酮的促心肌纖維化作用。筆者認為，CFs的iNOS-NO系統活性的變化參與了他汀類藥物抑制醛固酮促心肌纖維化作用。但他汀類藥物調控iNOS-NO系統的信號轉導通路還有待進一步研究。

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