基底細胞樣乳腺癌組織中Apaf-1、Caspase-9的表達變化及意義

張丙信，趙 霞，陳 雪，周炳娟，趙文明，李金梅，孫吉瑞，張金庫

(保定市第一中心醫院，河北保定071000)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年新發病例近百萬，嚴重威脅女性健康［1］。基底細胞樣乳腺癌(BLBC)是乳腺癌的一個亞型，其組織病理學、臨床表現及免疫表型均具特征性，且具有較高的增殖指數和預后不良的生物學行為。近年通過對細胞凋亡的研究，發現腫瘤細胞凋亡失控與腫瘤組織的生長關系密切。因此，研究BLBC細胞的凋亡對于了解BLBC的發生、發展有重要的意義。本研究采用免疫組法對BLBC組織中與細胞凋亡有關的 Apaf-1、Caspase-9蛋白進行檢測，初步探討Apaf-1和Caspase-9在BLBC發生、發展中所起的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2006年1月～2013年12月我院收治的BLBC患者43例(A組)，均為女性;年齡24～69歲，中位年齡56歲，其中＜50歲27例，≥50歲16例;所有患者術前均未進行放療、化療及內分泌治療。手術留取BLBC組織標本43例份，標本均經術后病理證實。腫瘤直徑＜2 cm者25例，≥2 cm者18例;有淋巴結轉移23例;臨床分期Ⅰ～Ⅱ期16例，Ⅲ～Ⅳ期27例。非基底細胞樣乳腺癌標本57例份(B組)，患者均為女性;年齡25～84歲，中位年齡49歲。另取距BLBC邊緣5 cm的正常乳腺組織60例份(C組)，患者均為女性;年齡25～63歲，中位年齡42歲。

1.2 試劑 兔抗人Apaf-1和Caspase-9多克隆抗體購自Affinity Biosciences公司，工作液濃度1∶100，ER、PR、C-erbB-2、CK5/6(MAB-0276)、表皮生長因子受體、即用型快捷免疫組化MaxVision檢測試劑盒(KIT-5020)和氨基聯苯胺(DAB-0031)顯色試劑盒均購自福州邁新生物公司。

1.3 Apaf-1、Caspase-9的檢測 采用免疫組化二步法。標本常規取材，4%中性甲醛固定，常規石蠟包埋，4 μm厚連續切片。操作步驟均按照產品說明書進行，采用檸檬酸修復液(pH6.0)高溫高壓修復抗原，以Apaf-1、Caspase-9陽性的胃組織作為陽性對照，以PBS替代一抗作為陰性對照，DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片。結果判定標準:Apaf-1、Caspase-9在陽性反應為在細胞質中出現明確棕黃色顆粒。結果由兩位資深病理醫師采用盲法以每張切片在200倍鏡下觀察整體染色情況，隨機讀取100個細胞。陽性細胞率=陽性細胞數/總細胞數×100%。切片中陽性細胞率≥5%為陽性病例，＜5%為陰性病例。

1.4 統計學方法 采用 SPSS17.0統計軟件。Apaf-1和Caspase-9的表達及其與BLBC的臨床病理因素的分析采用 χ2檢驗，相關性分析采用Spearman相關分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組 Apaf-1、Caspase-9表達比較 A、B、C組Apaf-1 陽性率分別為 23.3%(10/43)、49.1%(28/57)、75%(45/60)，兩兩比較，P 均 ＜0.01;Caspase-9 陽性率分別為 27.9%(12/43)、54.4%(31/57)、85%(51/60)，兩兩比較，P 均 ＜0.01。

2.2 Apaf-1、Caspase-9表達與BLBC臨床病理參數的關系 結果見表1。由表1可知，Apaf-1表達與BLBC腫瘤直徑、淋巴結轉移、臨床分期有關(P均＜0.05)，Caspase-9表達與 BLBC 淋巴結轉移、臨床分期有關(P均＜0.05)。

表1 Apaf-1、Caspase-9表達與BLBC臨床病理參數的關系

2.3 BLBC組織Apaf-1與Caspase-9陽性表達的關系 Spearman相關分析顯示，BLBC組織Apaf-1與Caspase-9 陽性表達呈正相關(r=0.639，P ＜0.01)。

3 討論

BLBC是從分子角度上定義，強調具有基底細胞基因表型，且表達基底細胞角蛋白與肌上皮標志物的一種特殊類型的乳腺癌。2003年Sorlie等［2］對乳腺癌進行基因分析，將乳腺癌分為5種亞型，即管腔A型、管腔B型、正常乳腺樣型、HER-2過表達型及基底細胞樣型，并指出這些亞型在生物學特性上是完全獨立的，其中BLBC的基因表達獨特，預后較一般浸潤性乳腺癌差，具有重要的臨床病理意義。目前，為大部分學者所接受的BLBC免疫表型為在“三聯陰性”(即ER、PR、HER-2均呈陰性)的基礎上，同時表達一種或一種以上的基底細胞型角蛋白(如 CK5/6、CK14 等)和(或)EGFR。據文獻［3］報道，BLBC占全部乳腺癌的8%～20%。在相關的幾項研究中，BLBC 平均發病年齡為 47～55歲［4～6］。但目前國內外文獻報道尚有差異，尚待進一步研究。BLBC通常呈浸潤性生長，多發生肺等遠處轉移，其組織結構特點主要有腫瘤主要為膨脹性生長，腫瘤組織排列成實性片塊狀，缺乏腺管樣結構，間質成分較少，癌巢中部常見無細胞纖維區帶，癌腫周邊常見大量淋巴細胞浸潤，可見成片的地圖樣壞死，腫瘤細胞多形性、異型性明顯，呈合胞體樣，核濃染、核仁明顯［7］。

細胞凋亡指生物體內的細胞在某一發育階段由基因調控的、自主的、有序的死亡過程［8］。相關研究發現，細胞凋亡抑制與細胞增殖增強都是腫瘤發生的生物學基礎。其中，細胞調亡主要有兩條通路，即Fas/TNFR1介導的死亡受體通路及線粒體依賴通路。Apaf-1是一個具有多功能結構域的蛋白，相對分子質量量為130 kD，是線粒體依賴途徑的關鍵蛋白酶之一，由3個結構域組成，其氨基末端有一個半胱氨酸蛋白酶募集域(CARD)，CED24同源域內包含一個保守的P環，羧基末端則由12個WD240重復片段組成。Caspase家族是一種半胱氨酸蛋白酶家族，共分為三類，即凋亡啟動因子、凋亡執行因子及炎癥介導因子。凋亡啟動因子位于級聯反應的上游，包括 Caspase-8、Caspase-9等，細胞中的Caspase均以無活性的酶原形式(Pro-Caspase)存在，當受到凋亡信號刺激后，通過對天冬氨酸殘基位點的蛋白水解而激活。當細胞的凋亡刺激啟動凋亡程序后，細胞色素C便從線粒體上特定的通道進入胞液，在dATP的作用下，Apaf-1發生構象改變而活化，活化的Apaf-1借助N端的CARD結構域與Pro-Caspase-9分子中的CARD結構域寡聚化，形成凋亡小體，這促使 Pro-Caspase-9自身活化，活化的Caspase-9激活下游的一系列Caspase成員，切割特定的凋亡底物，誘導細胞凋亡［8～11］。董明明等［12］研究Apaf-1在肝細胞癌中表達率較癌旁正常組織明顯降低，婁毅等［13］檢測Apaf-1在胃癌中表達率較正常胃組織降低，潘科等［14］在胃癌中檢測Caspase-9表達較正常胃組織降低，王敏等［15］研究顯示，Caspase-9在胃癌中的表達率較癌旁正常組織明顯降低，差異有統計學意義。這些研究結果均與本研究結論一致。

本研究顯示，A組Apaf-1、Caspase-9均低于其余兩組，且Apaf-1表達與BLBC腫瘤直徑、淋巴結轉移、臨床分期有關，Caspase-9表達與BLBC淋巴結轉移、臨床分期有關，Apaf-1與Caspase-9陽性表達呈正相關，提示Apaf-1和Caspase-9與BLBC的發生、發展可能相關。

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