結腸癌組織中Ku70、轉錄因子Sp1的表達變化及意義

胡 楠，鄭義同，吳風雷

(連云港市第一人民醫院，江蘇連云港222002)

Ku70是完成DNA雙鏈斷裂修復途徑關鍵成分DNA依賴蛋白激酶(DNA-PK)的重要組成部分［1］。近年來，由于對DNA修復系統與腫瘤發生、發展的關注，Ku70作為重要的DNA修復因子成為研究熱點。研究者們通過多種實驗方法檢測了Ku70在人體不同組織中的分布，發現在正常組織向腫瘤進展過程中，組織細胞中Ku70表達各異。目前Ku70在消化道腫瘤方面的研究較少。特異性蛋白1(Sp1)是一個序列特異的DNA結合蛋白，在調節腫瘤細胞生長、分化、轉移及血管生成過程中起重要作用［2，3］。研究發現，Sp1在結腸癌發生發展中發揮重要作用，可能是一個新的生物學標志，然而Sp1表達與結腸癌發生發展及作用機制尚不清楚。本研究分別采用免疫組化SP法、RT-PCR法檢測結腸癌及癌旁正常組織中Ku70和Sp1蛋白及mRNA，觀察兩指標的表達變化，探討二者的相關性。旨在更好地了解Ku70、Sp1基因對結腸癌發生發展的影響，以便發現新的腫瘤靶向治療靶點。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2012年10月～2014年6月連云港市第一人民醫院收治的結腸癌患者61例，男32例，女29例;年齡(65±9)歲。術前均未接受放、化療治療。手術切除結腸癌組織及距腫瘤邊緣5 cm以外的正常結腸黏膜組織。病理檢查證實均為腺癌;其中高分化15例，中分化33例，低分化13例;有淋巴結轉移者39例。組織標本于-80℃液氮保存，用10%甲醛固定，常規脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，5 μm連續石蠟切片。

1.2 試劑 TRIzol總RNA提取試劑盒購自Invitrigen公司。SABC(Strept Avidin-Biotin Complex)免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒、兔抗人Ku70、Sp1單 克隆抗體購自武漢博士德公司。

1.3 Ku70、Sp1蛋白的檢測方法 采用免疫組化SP法。染色步驟按試劑盒說明書進行。Ku70、Sp1工作液濃度分別以1∶200，1∶150稀釋，用 PBS替代一抗做陰性對照。染色強度分數標準:無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。同樣物鏡下陽性細胞百分比≤10%為1分、11%～50%為2分、51%～75%為3分、＞75%為4分。上述兩類分數的乘積≥3為陽性。

1.4 Ku70、Sp1 mRNA的檢測方法 采用RT-PCR法。總RNA提取和RT-PCR擴增分別按TRIzol試劑盒說明進行。Ku70和Sp1的PCR引物序列由上海博亞生物公司合成，Ku70基因上游引物:5'-GGGTCTGTGCCAACCTCTTTA-3';下游引物:5'-CAGCTTTAACCTGCTGAGTGC-3'，擴增長度341 bp;Sp1上游引物:5'-TGGTGGGCAGTATGTTGT-3'，下 游 引 物:5'-GCTATTGGCATTGGTGAA-3'，擴增長度550 bp;內對照β-actin上游引物:5'-CGGGAAATCGTGCGTGACATT-3'，下游引物:5'-CGTCAGGCAGCTCGTAGCTCTT-3'，擴增長度118 bp。RT-PCR反應條件為:70℃、5 min，冰浴 10 min，42 ℃、60 min，95 ℃、5 min，冰浴，以 94℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min，循環30 個周期后72℃延伸10 min。將產物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，每次上樣量均為6 μL，在紫外燈上觀察電泳結果，用Syngene凝膠成像分析系統分析。計算所得產物的積分吸光度與各自內參照積分吸光度的比值，觀察該基因mRNA的表達。

1.5 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。計量資料以±s表示，兩組比較用t檢驗率的比較用χ2檢驗，采用Spearman等級相關法分析Ku70、Sp1間的關系。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

Ku70蛋白主要著色于腫瘤細胞的胞質內，結腸癌組織與癌旁正常組織中Ku70陽性表達率分別為68.9%(42/61)、36.1%(22/61)，兩者比較，P ＜0.05(χ2=13.1)。Sp1 蛋白主要在血管內皮細胞胞質及胞核中表達，結腸癌癌組織與癌旁正常組織中Sp1 陽性表達率分別為 78.7%(48/61)、26.2%(16/61)，兩者比較，P ＜0.05(χ2=33.7)。結腸癌和癌旁正常組織中Ku70 mRNA的相對表達量分別為1.184 ± 0.410、0.845 ± 0.424，兩者比較，P ＜0.05(t=1.897)，Sp1 mRNA 的相對表達量分別為1.280 ±0.311、0.912 ±0.362，兩者比較，P ＜0.05(t=2.097)，見圖1。Ku70 mRNA 和 Sp1 mRNA 在結腸癌組織中表達呈正相關(r=0.398，P=0.029)。Sp1和Ku70蛋白表達均與結腸癌臨床病理參數的關系見表1。Sp1、Ku70蛋白表達與結腸癌腫瘤直徑、分化程度、淋巴結轉移、臨床分期有關(P均＜0.05)。

圖1 Ku70 mRNA、Sp1 mRNA在癌旁正常組織和結腸癌中的表達

3 討論

Ku70最早發現于多發性肌炎綜合征患者自身抗原，是完成DNA雙鏈斷裂修復途徑關鍵成分DNA-PK的重要組成部分，在諸多腫瘤組織中呈高表達，且在不同腫瘤進展過程中Ku70表達各異［4，5］。Economopoulou 等［6］通過Western blotting方法檢測了Ku70在成人骨髓異常增生綜合征中的表達發現，核型預后較好的患者Ku70表達率低。另有研究［7］發現，不同腫瘤組織中Ku70表達與腫瘤的侵襲轉移有關。本研究結果顯示，結腸癌組織中Ku70表達明顯高于癌旁正常組織，這一結果與Mazzarelli等［8］研究一致。

表1 Sp1和Ku70蛋白表達與結腸癌臨床病理參數的關系

轉錄因子是一種具有DNA結合序列的特殊蛋白［9～11］，可與誘導細胞增強元件相互作用，通過開啟、關閉、增強或減弱等控制靶基因有選擇的表達［10，11］。Sp1 是 Sp1/Krüppel樣轉錄因子家族成員之一，是該家族中最早鑒定且功能研究較廣泛的蛋白，通過與基因啟動子區的GC盒結合以及其他蛋白質相互作用的核轉錄因子，與許多靶基因的啟動轉錄有關，在細胞增殖、凋亡、分化和腫瘤形成等過程中起重要作用［14，15］。Zhao 等［16］研究發現，通過干擾RNA沉默Sp1表達，可抑制結腸癌干細胞的生長并促進其凋亡。本研究結果顯示，結腸癌組織中Sp1表達明顯升高，提示Sp1參與結腸癌的發生發展過程，并可能作為患者預后評價的重要指標。

目前，導致Sp1過度活化的機制尚不清楚，Sp1蛋白的修飾降解可直接調節其轉錄活性。在轉錄水平上，Ku70基因與Sp1轉錄因子形成復合物，已有研究證實Ku70基因的近端啟動子區富含GC序列，其中“GGCGGG”序列是轉錄因子Sp1的順式作用元件。Sp1與之結合后，與RNA聚合酶等共同構成轉錄復合物，促進Ku70的轉錄［17］。本研究結果顯示，Sp1與Ku70表達呈正相關，可能由于Ku70啟動子區富含GC盒，是典型的TATA-Less啟動子，在轉錄起始點上游存在多個反式作用因子Sp1結合點［17］，促進Ku70基因的轉錄。本研究結果提示二者的表達與腫瘤發生發展及惡性程度及腫瘤轉移有一定關系，Sp1與Ku70表達的一致性較好，隨著腫瘤的發生發展、惡性程度的增高，Sp1與Ku70表達均明顯增強。正常細胞調控機制下二者可使受損細胞的DNA修復，防止細胞癌變，其活性的增強則可能為腫瘤細胞無限增殖，同時抑制了正常細胞DNA自發損傷的修復，促使腫瘤細胞的DNA修復，進而降低了放化療的敏感性。

由此可見，Ku70和Sp1在結腸癌中高表達，與結腸癌的侵襲、轉移有關，二者可作為結腸癌發生發展的預測指標。對Sp1與Ku70基因的深入研究有可能使其作為結腸腫瘤惡變的標志物，在腫瘤預防、診斷及治療等方面提供重要的理論依據，但Sp1與Ku70在結腸腫瘤組織發生、侵襲及轉移中的具體調控機制尚待進一步研究。

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