頸動脈斑塊破裂動物模型的建立

韓學府，王麗麗，王 健，陳 茜，楊 笛

(1濰坊市人民醫院，山東濰坊261000;2南京醫科大學第一附屬醫院)

動脈粥樣硬化(AS)是心腦血管疾病的發病基礎。臨床上各種急癥多是由易損斑塊發生破裂及血栓形成，部分或完全阻塞管腔引起相應器官缺血壞死所致，但尚不明確導致斑塊不穩定及破裂的確切機制。載脂蛋白E(ApoE)缺陷小鼠普通飲食即可自發高脂血癥［1，2］。大量研究［3～5］報道了 ApoE 缺陷小鼠各級動脈斑塊病變的過程，病變中包含大量脂質、泡沫細胞和動脈內膜增生等，但很少觀察到斑塊破裂。已有的小鼠斑塊破裂模型由于實驗周期長，重復性差，斑塊破裂率低等原因引起廣泛的爭議。目前尚沒有一種公認的斑塊破裂模型。有研究者［6，7］通過在ApoE缺陷小鼠左側頸總動脈結扎并套管誘發了明顯的斑塊破裂，創造出一種新的動脈斑塊破裂模型。該模型由于簡便、快速、重復性好、斑塊破裂率高等優點大大改善了以往模型的弊端。本研究建立了ApoE缺陷小鼠頸動脈斑塊破裂模型，并初步探討該模型意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8周齡、雄性、ApoE缺陷小鼠36只，購自北京大學動物試驗中心，SPF級，合格證號為SCXK(京)2006-0008，普通飲食。

1.2 試劑與儀器 兔抗小鼠vWF一抗(abcam，1∶800)、兔抗小鼠 αSMC-actin 一抗(abcam，1∶100)、生物素標記山羊抗兔二抗(Vector Laboratories，1∶200)、R.T.U.ABC kit(Vector Laboratories，1∶200)、DAB 顯色液(Vector Laboratories，SK-4100)。雙目體式顯微鏡(南京江南永新光學有限公司)、熒光顯微鏡(Carl Zeiss，Inc)。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物分組 36只ApoE缺陷小鼠隨機分為6組:未結扎組、單純結扎組、結扎套管2天組、結扎套管4天組、結扎套管7天組和假手術組(套管后即取下)，各6只。實驗在濰坊醫學院動物飼養中心SPF級環境中進行。動物實驗操作均遵循動物實驗規章制度。

1.3.2 小鼠斑塊破裂模型的制作 小鼠適應性飼養1周后9周齡時開始實驗。未結扎組繼續普通飲食4周，其他組小鼠用7.5%水合氯醛(0.1 mL/20 g，4 ℃避光保存)麻醉固定，體式鏡下沿頸部正中做一長約1 cm矢狀切口，逐層剝離組織，分離左側頸總動脈，注意勿傷及迷走神經和靜脈。用絲線在頸總動脈分叉處近端結扎血管，完全阻斷血流，逐層縫合組織，普通小鼠飼料喂養4周，飲水不限。4周后，未結扎組與單純結扎組小鼠麻醉取材，套管各組和假手術組小鼠再次分離左側頸總動脈，并于結扎處近端置一聚乙烯管(長度2 mm，外徑0.965 mm，內徑0.580 mm，BD Biosciences)，絲線固定套管，縫合組織。結扎套管2天組、結扎套管4天組、結扎套管7天組分別于套管后的第2天、第4天和第7天取材。假手術組小鼠套管后即刻取下套管，術后2周取材。

1.3.3 觀察方法 動脈取材后，冷PBS清洗，浸入4%多聚甲醛固定。制作石蠟切片，行連續切片，每隔60 μm切片行HE染色和Masson染色，免疫組織化學觀察管腔斑塊內α肌動蛋白(αSMC-actin)和血管性血友病因子(vWF)的表達狀況。用HE染色切片觀察所有小鼠頸總動脈內斑塊形態，使用Photoshop 7.0和Image Pro Plus 6.0研究頸總動脈結扎、套管前后管腔狹窄程度(管腔狹窄率為新生內膜面積占管腔面積的百分數)、中膜厚度(內外彈力膜間垂直距離，分別于血管 0、2、4、6、8、10 點方向處測量，取其均值)、單位中膜面積細胞數(內外彈力膜間細胞數，以細胞核數為準)和斑塊內膠原含量的變化。

1.3.4 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件。未結扎組與單純結扎組小鼠管腔狹窄程度、中膜厚度和單位中膜面積細胞數數據采用兩獨立樣本t檢驗;單純結扎組與套管各組管腔狹窄程度、中膜厚度、膠原含量和單位中膜面積細胞數數據采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

未結扎組、單純結扎組管腔狹窄率分別為0.10% ±0.018%、0.88% ±0.033%，中膜厚度分別為(0.44 ±0.02)、(0.70 ±0.04)mm，單位中膜面積細胞數分別為(16.5 ±1.03)、(12.7 ±1.07)個，兩組比較，P均＜0.05。單純結扎組小鼠自結扎動脈遠端至近端血管可見管腔內膜增生明顯，管腔狹窄，斑塊內散在分布大量泡沫細胞，斑塊表面可見明顯纖維帽形成(圖1)。單純結扎組、結扎套管2天組、結扎套管4天組、結扎套管7天組和假手術組斑塊破裂分別為0、5、4、6、0只。未結扎組管壁內無膠原表達，其他各組斑塊內及斑塊破裂處均有膠原表達，但斑塊破裂后膠原明顯較少。單純結扎組、結扎套管2天組、結扎套管4天組、結扎套管7天組和假手術組單位斑塊面積內膠原含量分別為0.47±0.04、0.09 ±0.03、0.12 ±0.04、0.16 ±0.08、0.41 ±0.07，單純結扎組與假手術組比較，P＞0.05，單純結扎組與套管各組比較，P均＜0.05。單純結扎組動脈斑塊內部和纖維帽處均可檢測到αSMC-actin表達，但纖維帽處表達更明顯;斑塊破裂后局部仍有表達，但纖維帽處表達減弱。vWF在部分斑塊內表達，在斑塊破裂處無表達(圖2)。

圖1 單純結扎組結扎動脈血管HE染色(×400)

圖2 破裂斑塊αSMC-actin、vWF免疫組織化學染色

3 討論

正常ApoE缺陷小鼠普通飲食4周后血管內膜光滑平整，中膜僅由3～4層彈力膜及平滑肌細胞組成，外膜細胞成分少。動脈結扎4周后，管腔內出現了明顯的富含膠原的新生內膜，該內膜中伴有泡沫細胞聚集和纖維帽形成，通過免疫組織化學方法于斑塊內可檢測到αSMC-actin及vWF因子的表達，行Masson染色于斑塊內檢測到膠原蛋白表達。可見，我們通過結扎小鼠頸總動脈，并飼以普通飲食，在其管腔內形成了富含膠原、平滑肌細胞、內皮細胞、泡沫細胞的斑塊，雖然該斑塊與人類斑塊形態上仍有差異，但該新生內膜中包含了纖維帽、脂質池等斑塊的基本特征［8，9］。因此，該新生內膜可稱其為斑塊。4周后通過血管外置管來誘發斑塊破裂。套管后2、4和7 d均出現了斑塊破裂，但套管7 d后全部小鼠斑塊均發生破裂。15只ApoE缺陷小鼠套管后發生斑塊破裂，其中發生破裂伴斑塊內出血10(66.7%)只，發生破裂伴管腔內血栓形成4(26.7%)只，發生斑塊脫落1(6.7%)只，提示本模型小鼠斑塊破裂的主要表現是斑塊破裂伴出血。假手術組小鼠均未出現斑塊破裂，提示手術操作過程不會對斑塊破裂造成影響。

單純結扎組較未結扎組管腔狹窄、管壁增厚、管壁單位面積細胞數減少，均提示結扎促使了血管發生病理性重塑。vWF僅在正常血管內有表達，結扎和套管后血管管腔內均未見表達，而在部分斑塊內出現表達，提示在該模型小鼠斑塊內并發新生血管的形成，而此可導致斑塊不穩定，容易發生破裂。大量的αSMC-actin細胞彌漫性分布于斑塊內，而在管壁中的表達減弱甚至消失，而且在管壁內彈力膜斷裂處可見細胞發生遷移，均提示中膜平滑肌細胞可能遷移至管腔參與了斑塊的形成。有研究者［10，11］分別證明結扎ApoE缺陷小鼠頸總動脈后管腔內形成的斑塊內富含平滑肌和巨噬細胞。套管后促使斑塊發生破裂，破裂斑塊纖維帽處αSMC-actin表達減弱，同時斑塊內膠原含量也減少，提示平滑肌細胞的減少和膠原含量的下降可能為導致斑塊破裂的機制之一。

已有的ApoE缺陷小鼠斑塊破裂模型采用長時間(42～54周)普通飲食飼養［5］，或飼以高脂飲食2個月［12］誘發頭臂干動脈不穩定斑塊形成，或通過血管外套管誘發動脈斑塊形成，后轉入p53蛋白，加用血管收縮劑促進斑塊破裂［13，14］或利用血流動力學在低剪切力區形成不穩定斑塊，加用血管收縮劑誘發破裂［15］等方法，但這些模型存在實驗周期長，重復性差、斑塊破裂率低等問題。與這些模型相比，該模型具有簡便，快速，斑塊破裂率高，重復性好等優勢。該動物模型也有自己的缺陷和不足，如斑塊是由血管損傷后誘發形成，形態上并非典型的動脈粥樣硬化斑塊，斑塊內脂質成分少，膠原分布彌漫，斑塊內未見鈣化等。套管后斑塊內多處出現出血，但并未見明顯的破裂口，斑塊內出血可能由斑塊內新生血管形成所致。因此，該模型小鼠斑塊破裂的機制有待進一步研究。我們通過結扎頸總動脈在管腔內產生了富含平滑肌細胞、泡沫細胞和膠原的斑塊，通過套管誘發了斑塊破裂、出血及血栓形成。雖然該模型斑塊破裂的機制有待進一步研究，但該模型小鼠為在體研究致斑塊破裂因素提供了良好的平臺。

［1］Jackson CL.Ruptures of delight A new mouse model of plaque rupture［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006，26(6):1191-1192.

［2］Plump AS，Smith JD，Hayek T，et al.Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells［J］.Cell，1992，71(2):343-353.

［3］Falk E.Pathogenesis of atherosclerosis［J］.J Am Coll Cardiol，2006，47(8 Suppl):C7-12.

［4］Nakashima Y，Plump AS，Raines EW，et al.ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree［J］.Arterioscler Thromb，1994，14(1):133-140.

［5］Rosenfeld ME，Polinsky P，Virmani R，et al.Advanced atherosclerotic lesions in the innominate artery of the ApoE knockout mouse［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2000，20(12):2587-2592.

［6］Sasaki T，Kuzuya M，Nakamura K，et al.A simple method of plaque rupture induction in apolipoprotein E-deficient mice［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006，26(6):1304-1309.

［7］Nakamura K，Sasaki T，Cheng XW，et al.Statin prevents plaque disruption in apoE-knockout mouse model through pleiotropic effect on acute inflammation［J］.Atherosclerosis，2009，206(2):355-361.

［8］Falk E，Shah PK，Fuster V.Coronary plaque disruption［J］.Circulation，1995，92(3):657-671.

［9］Kristensen SD，Ravn HB，Falk E.Insights into the pathophysiology of unstable coronary artery disease［J］.Am J Cardiol，1997，80(5A):5E-9E.

［10］Kawasaki T，Dewerchin M，Lijnen HR，et al.Mouse carotid artery ligation induces platelet-leukocyte-dependent luminal fibrin，required for neointima development［J］.Circ Res，2001，88(2):159-166.

［11］Ivan E，Khatri JJ，Johnson C，et al.Expansive arterial remodeling is associated with increased neointimal macrophage foam cell content:the murine model of macrophage-rich carotid artery lesions［J］.Circulation，2002，105(22):2686-2691.

［12］Johnson J，Carson K，Williams H，et al.Plaque rupture after short periods of fat feeding in the apolipoprotein E-knockout mouse:model characterization and effects of pravastatin treatment［J］.Circulation，2005，111(11):1422-1430.

［13］von der Thüsen JH，van Berkel TJ，Biessen EA.Induction of rapid atherogenesis by perivascular carotid collar placement in apolipoprotein E-deficient and low-density lipoprotein receptor-deficient mice［J］.Circulation，2001，103(8):1164-1170.

［14］von der Thüsen JH，van Vlijmen BJ，Hoeben RC，et al.Induction of atherosclerotic plaque rupture in apolipoprotein E-/-mice after adenovirus-mediated transfer of p53［J］.Circulation，2002，105(17):2064-2070.

［15］Cheng C，Tempel D，van Haperen R，et al.Atherosclerotic lesion size and vulnerability are determined by patterns of fluid shear stress［J］.Circulation，2006，113(23):2744-2753.