腎癌組織中mTOR、P70S6K蛋白的表達變化及意義

劉國斌，單廣夷，孔垂?jié)?/p>

(1中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，沈陽110000;2寬甸中心醫(yī)院)

腎癌是泌尿系統常見的惡性腫瘤，占成人惡性腫瘤的2%～3%，且呈逐年上升趨勢。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬磷酸肌醇激酶成員，主要控制細胞周期進程，對細胞分化、凋亡起重要作用［1，2］。研究［3］表明，腫瘤中 mTOR表達失調［3］。核糖體蛋白S6激酶(P70S6K)是核糖體40S小亞基S6蛋白激酶，是mTOR的直接作用底物，被mTOR磷酸化后激活，控制含5'-TOP結構的mRNA翻譯［4～7］，激活S6從而使核糖體40S小亞基易于結合翻譯復合物，促進蛋白質合成。本研究觀察了腎癌組織中mTOR、P70S6K蛋白的表達變化，并探討其意義。

1 材料與方法

1.1 材料 109例腎癌組織均來自中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院2006～2008年手術切除標本。腎癌患者中男51例、女58例，年齡34～81歲、平均53歲。按2004年WHO病理組織學分類，其中透明細胞癌94例，乳頭狀癌15例。組織學分級:高分化50例，中分化37例，低分化22例。按ROBSON臨床分期，Ⅰ期46例，Ⅱ期35例，Ⅲ、Ⅳ期28例。收集距離腫瘤邊緣5 cm外的正常腎臟組織20例作為對照，全部標本術前均未接受化療及放療，標本離體5 min內經液氮速凍后置-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫薪M織用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。

1.2 主要試劑 mTOR多克隆抗體購于Santa Cruz公司;P70S6K多克隆抗體購于南京有為生物科技有限公司;DAB顯色系統購自福州邁新公司;RIPA裂解液﹑GAPDH和β-actin購于碧云天試劑公司;S-P免疫組化試劑盒購于北京中杉金橋公司。

1.3 mTOR、P70S6K蛋白檢測 免疫組化檢測:應用SP法進行免疫組化實驗，操作按試劑盒說明書進行。以PBS代替一抗作為陰性對照，結果判定:依據染色強度+陽性細胞計數評分。①染色強度分數標準:無色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。②陽性細胞數:同樣物鏡下計數陽性細胞數，1%～10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，75%以上為4分。兩項得分相乘，滿3分為+，4、5分為++，6分以上為 +++，+～+++為陽性表達。Western blotting實驗:提取蛋白，上樣電泳，濕轉后分別加入一抗mTOR(1∶200)，室溫下2 h。加入堿性磷酸酶標記的二抗P70S6K(1∶2 000)，室溫下2 h。選取β-actin作為內參照，用ImageJ進行灰度分析。

1.4 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。計量資料以±s表示，組間比較用t檢驗;計數資料比較用χ2檢驗，兩變量間的相關性檢驗采用Spearman等級相關分析法。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腎癌、正常腎組織中mTOR、P70S6K蛋白的表達 mTOR蛋白在腎癌、正常腎組織中的表達水平分別為1.223 ±0.125、0.667 ±0.106，兩者比較，P＜0.01;P70S6K在腎癌、正常腎組織的表達水平分別為 1.108 ±0.258、0.489 ±0.21，兩者比較，P ＜0.01。高、中、低分化腎癌中mTOR蛋白的表達分別為 0.72 ± 0.01、0.91 ± 0.07、1.24 ± 0.13，P70S6K蛋白的表達分別為 0.57 ±0.01、0.79 ±0.01、1.13±0.01。mTOR、P70S6K蛋白在腎癌各組織學分級間的表達差異均有統計學意義(P均＜0.01)。

2.2 mTOR、P70S6K蛋白表達與腎癌臨床病理參數的關系 mTOR蛋白定位于細胞質，細胞膜中亦有著色，在109例腎癌組織中有87例陽性表達，表達率為79.8%。P70S6K蛋白定位于細胞質，在109例腎癌組織中90例陽性表達，表達率為82.6%。mTOR、P70S6K蛋白陽性表達與腎癌的組織分化程度、淋巴結轉移和臨床分期有關(P均＜0.05)，與患者性別、年齡無關(P均＞0.05)。詳見表1。

表1 mTOR、P70S6K蛋白表達與腎癌臨床病理參數的關系

2.3 腎癌組織中mTOR與P70S6K蛋白表達的相關性 在87例mTOR蛋白表達陽性的腎癌組織中有84例P70S6K蛋白表達陽性，陰性表達有3例。而在22例mTOR蛋白表達陰性的腎癌組織中有16例P70S6K蛋白表達陰性，陽性表達有6例。mTOR與 P70S6K 表達呈正相關(r=0.478，P=0.002)。

3 討論

腎癌在泌尿系腫瘤中較常見，僅次于膀胱癌。腎癌的病因未明，已明確與腎癌發(fā)病相關因素有遺傳、吸煙、肥胖、高血壓及抗高血壓治療等。TOR是近年來發(fā)現的一類進化上保守的蛋白家族，在哺乳動物中只發(fā)現一種TOR蛋白，即mTOR［6］，其相對分子質量為289 kD，含有2 549個氨基酸殘基，對細胞的分化、凋亡起重要作用［1，2］。mTOR信號傳導通路活化可抑制多種刺激誘發(fā)的細胞凋亡，促進細胞周期進展，從而促進細胞的生存和增殖，同時參與血管生成，在腫瘤形成中扮演重要角色，參與腫瘤的侵襲和轉移［8］。在體內，mTOR通過磷酸化多種底物蛋白實現其生理作用。P70S6K是其重要的底物之一［9］。

本實驗結果顯示，mTOR和P70S6K蛋白在癌旁正常腎組織中均呈低表達，在腎癌組織中均呈高表達，mTOR和P70S6K蛋白的表達隨腎細胞癌分化程度的降低而升高，同一標本中mTOR和P70S6K蛋白的表達有顯著的相關性。本實驗還觀察了mTOR和P70S6K蛋白在腎癌組織中的表達與臨床病理參數的關系，發(fā)現mTOR、P70S6K蛋白陽性表達與腎癌的組織分化程度、淋巴結轉移和臨床分期有關，與患者性別、年齡無關。我們認為在腎癌中存在異常活化的mTOR信號通路，而且mTOR的表達水平越高，mTOR下游的重要靶點P70S6K表達水平亦越高，從而使細胞中蛋白合成越快，細胞生長越快，進一步加速了細胞的惡化，mTOR和P70S6K蛋白的相互作用促進了腫瘤的發(fā)生。

綜上可見，mTOR和P70S6K蛋白表達與腎癌的發(fā)生、發(fā)展有密切關系，可能作為腎癌的一個特異性治療靶點。

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