PPARγ受體在大鼠缺氧性腎小管上皮細胞損傷中的表達及意義

蔣 玲，李正一，周志強，陳秀萍，雷鳳英，覃遠漢

（廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧 530021）

過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）屬于配體激活的核細胞受體超家族，為Ⅱ型核激素受體超家族成員，有 α、β、γ 三種亞型［1］。在腎臟內，PPARγ參與正常腎臟的發育、脂質代謝，具有調節水鹽重吸收、調控腎血流量并激活腎素—血管緊張素系統等生理功能［2，3］。目前，在單側輸尿管梗阻（UUO）大鼠模型中發現，PPARγ具有抗腎間質纖維化（RIF）作用［4］。然而PPARγ在體外培養的缺氧性腎小管上皮細胞（RTEC）中的表達及作用尚不清楚。2012年12月～2013年6月，為探討PPARγ在缺氧性RTEC損傷中的作用，我們進行了相關研究。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠缺氧性RTEC細胞株（NRK-52E）購自上海細胞庫;DMEM高糖培養基、超濾胎牛血清購自美國HyClone有限公司;羅格列酮（RGZ）、GW9662購自美國Sigma公司;二甲基亞砜購自索萊寶生物科技有限公司;其他均為常規儀器和試劑。

1.2 方法

1.2.1 模型制作及分組 將NRK-52E于37℃、5%CO2條件下置入含5%胎牛血清的DMEM高糖培養基中，待細胞生長至約80%融合時傳代。待傳代的細胞生長至對數期時，將細胞隨機分為4組:正常對照組、缺氧模型組、RGZ組及GW9662組。正常對照組常規培養，不予缺氧性損傷處理。缺氧模型組、RGZ組及GW9662組行缺氧性損傷處理［5］，同時RGZ組給予15 μmol/L RGZ、GW9662組給予25 μmol/L GW9662處理。36 h后收集細胞行相關指標檢測。

1.2.2 PPARγ、TGF-β1mRNA 表達檢測 采用 RTPCR法。按照RNA提取試劑盒說明提取細胞總RNA，選取完整的mRNA，按反轉錄試劑盒要求進行反轉錄，β-actin為內參。PPARγ上游引物:5＇-GATGACCACTCCCATTCCTTT-3＇，下 游 引 物:5＇-CGCACTTTGGTATTCTTGGAG-3＇，片 段 長 度 156 bp。TGF-β1上 游 引 物:5＇-CGCAATCTATGACAAAACCAAA-3＇，下 游 引 物:5＇-TTCTACGTGTTGCTCCACAGTT-3＇，片段長度 154 bp。β-actin 上游引物:5＇-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3＇，下 游 引 物:5＇-CCCATACCCACCATCACACC-3＇，片段長度 207 bp。反應體系為20 μL:2.5 ×Real MasterMix/SYBR solution 9.0 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.4 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.4 μL，cDNA 1 μL，超純水9.2 μL。PCR 反應條件:PPARγ:95 ℃預變性 10 min，68 ℃變性15 s，62 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，共進行40個循環;TGF-β1:95℃預變性10 min，68 ℃變性15 s，58 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，共進行40個循環。每樣本重復3次。以正常對照組的基因表達量為 1，采用相對定量 2-ΔΔCT法［6］計算其余各組mRNA的相對表達量。變化倍數（Fold change）為缺氧模型組、RGZ組和GW9662組較正常對照組基因的相對表達倍數。

1.2.3 PPARγ、TGF-β1蛋白表達檢測 采用Western blot法。按常規方法提取NRK-52E的總蛋白，二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。4℃、12 000 r/min離心后加入上樣緩沖液，煮沸變性后行Western blot檢測。以β-actin為內參，行10%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）、封閉液室溫封閉1 h、一抗4℃孵育過夜、二抗常溫避光孵育1.5 h，最后掃描PVDF分析蛋白表達量。

1.2.4 統計學方法 采用 SPSS13.0統計軟件，數據以±s表示，比較采用單因素方差分析q檢驗（SNK法）。相關性分析采用直線相關分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RTEC形態觀察 正常對照組RTEC形狀渾圓，細胞間隙清晰。缺氧模型組RTEC形狀變尖銳，出現萎縮，細胞間隙變寬加深，且寬度不一，細胞壁出現塌陷。與缺氧模型組比較，RGZ組RTEC萎縮減輕，細胞間隙變窄，細胞壁塌陷程度較輕;GW9662組RTEC萎縮加重，細胞間隙變寬。

2.2 各組 RTEC PPARγ、TGF-β1mRNA 表達比較見表1。

表1 各組RTEC PPARγ、TGF-β1mRNA表達比較

2.3 各組 RTEC PPARγ、TGF-β1蛋白表達比較見表2。

表2 各組 RTEC PPARγ、TGF-β1蛋白表達比較（ ±s）

表2 各組 RTEC PPARγ、TGF-β1蛋白表達比較（ ±s）

注:與正常對照組比較，*P ＜0.05;與缺氧模型組比較，#P ＜0.05

組別 n PPARγ TGF-β1正常對照組9 5.13 ±0.15 3.48 ±0.06缺氧模型組 9 4.28 ±0.39* 5.32 ±0.07*RGZ 組 9 4.85 ±0.11*# 4.75 ±0.09*#GW9662 組 9 2.27 ±0.17*# 7.49 ±0.12*#

2.4 缺氧性 RTEC 損傷中 PPARγ、TGF-β1蛋白表達的關系 缺氧性RTEC中PPARγ的蛋白表達與TGF-β1的蛋白表達呈負相關（r=-0.91，P＜0.05）。

3 討論

RTEC損傷是指腎小管受到缺氧、炎性因子、蛋白尿等因素作用后，RTEC活化、增殖，炎性因子分泌增加，并導致上皮細胞轉分化（EMT）。而EMT是RIF的早期可逆性階段，也是終末期腎病的主要病理改變［7］。目前認為，EMT導致的腎間質細胞成纖維化和細胞外基質沉積是RIF發生的中心環節和關鍵因素。因此認為，RTEC損傷與RIF的發生、發展密切相關［8］。

TGF-β1是目前發現的作用最強的致腎纖維化的細胞因子，具有刺激細胞外基質積聚、誘導產生下游致纖維化因子的作用，最終加劇RIF［9］。缺氧可導致上皮細胞中 TGF-β1和 α-平滑肌動蛋白（α-SMA）表達上調，出現Ⅳ型膠原纖維和纖維連接蛋白沉積。Matsuoka等［10］對胃癌細胞缺氧處理24 h后發現，胃癌細胞中 TGF-β1表達明顯升高。Copple［11］對肝上皮細胞缺氧處理后發現，EMT相關基因（如成纖維細胞特異蛋白、α-SMA）表達升高。因此，TGF-β1可作為細胞缺氧性損傷的檢測指標。本課題組前期研究發現，在UUO大鼠模型中，腎臟組織TGF-β1表達明顯升高，梗阻時間越長，TGF-β1表達越高，腎臟損傷越嚴重［12］。本研究結果顯示，缺氧模型組、RGZ組和GW9662組RTEC出現細胞萎縮，細胞壁塌陷，細胞間隙變寬，細胞損傷程度較正常對照組重;TGF-β1的蛋白表達量明顯高于正常對照組，提示本研究模型制備成功。

PPARγ在脂肪組織、肝臟、腎臟、血管上皮等組織廣泛分布并參與細胞的增殖、分化和凋亡。研究發現，PPARγ激動劑有保護腎臟及其細胞損傷的作用。如Lin等［13］報道，激動PPARγ可抑制高糖誘導的大麻素1受體高表達，減輕腎小球系膜炎癥反應和纖維化;Wei等［14］研究發現，在 TGF-β1誘導的大鼠RTEC 轉分化模型中，RGZ 可抑制 TGF-β1、α-SMA的表達，抑制轉分化。這些均提示PPARγ信號通路參與抑制纖維化的過程。本研究結果顯示，在缺氧性RTEC損傷中，PPARγ蛋白表達明顯降低，TGF-β1蛋白表達明顯升高，PPARγ的蛋白表達與TGF-β1的蛋白表達呈負相關，提示PPARγ蛋白的低表達可能參與了缺氧性RTEC損傷;在受體激動劑RGZ干預之后，RGZ組RTEC損傷較缺氧模型組明顯減輕，PPARγ蛋白的表達水平較缺氧模型組明顯增高，TGF-β1蛋白表達水平明顯降低，提示RGZ可能通過上調PPARγ蛋白的表達起到減輕RTEC損傷的作用;GW9662是高選擇性的PPARγ抑制劑，本研究GW9662組RTEC損傷較缺氧模型組明顯加重，PPARγ蛋白的表達水平較缺氧模型組明顯降低，TGF-β1蛋白的表達水平明顯增高，提示GW9662可能通過下調PPARγ蛋白的表達而加重RTEC損傷。

綜上所述，在缺氧性RTEC損傷中，PPARγ蛋白的低表達可能參與了RTEC損傷;RGZ可能通過上調PPARγ蛋白的表達而減輕RTEC損傷。

［1］Ciudin A，Hernandez C，Simo R.Update on cardiovascular safety of PPARgamma agonists and relevance to medicinal chemistry and clinical pharmacology［J］.Curr Top Med Chem，2012，12（6）:585-604.

［2］Kiss-Toth E，Roszer T.PPARgamma in kidney physiology and pathophysiology［J］.PPAR Res，2008，2008:183108.

［3］Todorov VT.PPARgamma-dependent control of renin expression:molecular mechanisms and pathophysiological relevance［J］.PPAR Res，2013，2013:451016.

［4］何泳，寧勇，曾銳，等.羅格列酮延緩慢性腎病進展的機制研究［J］.醫藥導報，2012，31（10）:1257-1261.

［5］關欣，李應東.細胞缺氧復氧模型建立方法的研究進展［J］.醫學綜述，2008，14（18）:2737-2739.

［6］Schmittgen TD，Livak KJ.Analyzing real-time PCR data by the comparative C（T）method［J］.Nat Protoc，2008，3（6）:1101-1108.

［7］Farris AB，Colvin RB.Renal interstitial fibrosis:mechanisms and evaluation［J］.Curr Opin Nephrol Hypertens，2012，21（3）:289-300.

［8］Liu Y.Cellular and molecular mechanisms of renal fibrosis［J］.Nat Rev Nephrol，2011，7（12）:684-696.

［9］Kartha G，Calle JC，Marchini GS，et al.Impact of stone disease:chronic kidney disease and quality of life［J］.Urol Clin North Am，2013，40（1）:135-147.

［10］Matsuoka J，Yashiro M，Doi Y，et al.Hypoxia stimulates the EMT of gastric cancer cells through autocrine TGF beta signaling［J］.Plos One，2013，8（5）:e62310.

［11］Copple BL.Hypoxia stimulates hepatocyte epithelial to mesenchymal transition by hypoxia-inducible factor and transforming growth factorbeta-dependent mechanisms［J］.Liver Int，2010，30（5）:669-682.

［12］Long YB，Qin YH，Zhou TB，et al.Association of retinoic acid receptors with extracellular matrix accumulation in rats with renal interstitial fibrosis disease［J］.Int J Mol Sci，2012，13（11）:14073-14085.

［13］Lin CL，Hsu YC，Lee PH，et al.Cannabinoid receptor 1 disturbance of PPARgamma2 augments hyperglycemia induction of mesangial inflammation and fibrosis in renal glomeruli［J］.J Mol Med（Berl），2014，92（7）:779-792.

［14］Wei J，Li Z，Yuan F.Evodiamine might inhibit TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in NRK52E cells via Smad and PPAR-gamma pathway［J］.Cell Biol Int，2014，38（7）:875-880.