堿性成纖維細胞生長因子對堿燒傷兔眼角膜新生血管的影響

郭立云，張潔瑩，孫 恒，胡竹林，邊 慧

（1昆明醫科大學第四附屬醫院，昆明 650021;2昆明醫科大學第二附屬醫院;3昆明醫科大學）

角膜疾病是造成眼盲的第二大因素，占全部眼盲患者的三分之一。輕中度角膜盲可通過供體的健康角膜移植得以復明。而嚴重角膜盲，尤其是重度酸、堿、熱燒傷等引起的眼瞼或結膜囊功能異常，嚴重天皰瘡、Stevens-Johnson綜合征、多次角膜移植術失敗伴植床嚴重新生血管化等角膜盲，因嚴重的排斥反應，手術復明率尚不足20%，常規角膜移植術的成功率幾乎為零。人工角膜成為這類角膜疾病復明的最后希望。但對人工角膜移植而言，材料與人體組織的生物相容性是影響人工角膜植入成敗的關鍵［1］。堿燒傷可誘導角膜產生新生血管［2］，但同時可產生嚴重的炎癥反應;而堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）能誘導角膜產生新生血管，并減少炎癥反應［3，4］。因此，我們推測 bFGF 既能促進堿燒傷兔眼角膜新生血管形成，又能降低炎癥反應。為此，2011年6月～2012年3月，我們進行了相關研究。

1 材料與方法

1.1 材料 健康日本大耳白兔12只（編號1～12），雌雄不限，體質量2 kg左右，由昆明醫學院動物科提供。0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液，日本參天制藥株式會社;Olympus雙目顯微鏡，日本奧林巴斯公司;bFGF注射液，美國 PeproTech公司;Leica CM1850冰凍切片機及冰凍切片，德國Leica公司。人工角膜為本課題組自制的2片夾持型人工角膜，前片為PMMA材料，后片為硅膠材料。

1.2 方法

1.2.1 動物模型及分組 ①隨機選大耳白兔10只（兔1～10）雙眼制備角膜堿燒傷模型。堿燒傷1周后，左眼球結膜下多點注射bFGF，右眼球結膜下多點注射生理鹽水。②選大耳白兔2只（兔11～12）左眼制備角膜堿燒傷模型，右眼為正常對照眼。③兔9～12進行病理學觀察。模型制備:配制濃度為1 mol/L的氫氧化鈉溶液，蘸于直徑為10 mm圓形濾紙片;將大耳白兔固定后，左眼用鹽酸奧布卡因滴眼液局部麻醉，將蘸有氫氧化鈉溶液的圓形濾紙片置于開瞼的兔眼角膜中央15 s后，立即生理鹽水沖洗結膜囊，紅霉素眼膏和阿托品眼膏涂抹結膜囊。隔日換藥，生理鹽水沖洗結膜囊，紅霉素眼膏和阿托品眼膏涂抹結膜囊。在堿燒傷1周后，隨機選10只大耳白兔，每日對其左眼（實驗組）球結膜下多點注射 bFGF 1 U（約 0.5 mL），1 次/d，連續 7 d［5］;對所有兔子右眼（對照組）球結膜下多點注射生理鹽水作為對照。

1.2.2 角膜新生血管生長情況觀察 兔眼角膜堿燒傷模型建立2個月后，隨機觀察兔1～8雙眼角膜新生血管生長情況。應用圖像分析系統將角膜分為300格，計數角膜紅變的區域，并統計分析。

1.2.3 兔眼人工角膜的植入 兔眼堿燒傷后2個月左右，從兔1～10中隨機選8只兔，雙眼行人工角膜植入術，植入的人工角膜為我們自制的2片夾持型人工角膜，瘢痕血管化的兔眼角膜夾持在兩片之間。植入后2個月內，仍然對兔眼進行球結膜下多點注射bFGF，方法同術前。2個月后停止注射。1周后利用裂隙燈觀察療效，即人工角膜生長情況、新生血管多少，以及有無角膜溶解、變薄或穿孔等現象。

1.2.4 角膜組織病理學觀察 空氣栓塞法處死兔9～12后，立即取出眼球，固定、脫水，冰凍切片后HE染色，觀察角膜病理學變化。

1.2.5 統計學方法 采用SPSS18.0統計軟件，計量資料以±s表示，比較采用配對t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 角膜新生血管生長情況 角膜堿燒傷2個月后，堿燒傷模型兔眼角膜平均紅變格數為203.23個，明顯多于正常對照兔眼角膜的168.65個（t=3.876，P＜0.01），即堿燒傷模型兔眼角膜新生血管形成量多于正常對照兔眼。見圖1。

圖1 角膜新生血管生長情況

2.2 人工角膜移植后角膜生長情況 人工角膜移植6個月，堿燒傷模型兔眼人工角膜生長情況良好，無一例角膜發生溶解、脫出等嚴重并發癥。正常對照兔眼中有2例角膜發生溶解穿孔，人工角膜脫出。見圖2。

圖2 人工角膜移植后生長情況

2.3 角膜病理組織學改變 正常對照眼角膜薄厚均一，上皮、內皮完整，基質細胞排列有序（圖3-1）;堿燒傷角膜上皮及內皮不完整，基質層細胞排列不規則可見紊亂的瘢痕組織，散在薄壁新生血管（圖3-2～3-4）;角膜堿燒傷后聯合注射bFGF眼角膜上皮、內皮完整，基質層細胞排列較規則，上皮下為排列緊密的基質瘢痕組織，較多薄壁新生血管（圖3-5）。

圖3 角膜堿燒傷及聯合注射bFGF后角膜組織切片HE染色

3 討論

人工角膜發展至今已有將近200年的歷史，其在一定程度上可以幫助角膜盲患者復明，但人工角膜與角膜周圍存有界面，不能緊密連接，故植床角膜及與異質材料接觸的組織往往發生萎縮、壞死或組織溶解等退行性病理改變，甚至發生房水滲透、眼內感染及人工角膜脫落等并發癥，極大地限制了其臨床應用。為此，本實驗對人工角膜及其受體植床的條件進行了探索，旨在為人工角膜應用于臨床積累有益的理論基礎。

以往我們的研究表明，本課題組自制的夾持型人工角膜移植后角膜溶解、穿孔是最常見的并發癥，發生率約為20%。其原因多為因角膜營養不足，如角膜瘢痕化不夠，對營養需求增加;移植前角膜血管化少，營養供應不足［6］。人工角膜移植術需要受體植床上新生血管足夠多，故如何增加移植術前角膜新生血管，就成了人工角膜植入后長期存活的關鍵。目前，引起角膜新生血管的方法有多種，如角膜縫線法、角膜堿燒傷法、角膜囊袋法、角膜緣干細胞破壞法等，大多數方法會增加炎癥反應，在導致角膜血管化的同時，引起角膜炎、角膜潰瘍及嚴重的前房虹膜反應，增加玻璃體混濁和繼發性青光眼的風險。而采用血管誘生劑在調節刺激新生血管生長的同時，不會增加炎癥反應。

bFGF是Gospodarowicz在1974年從人腦中分離純化出的一種多肽因子。bFGF在胚腦及成年腦中均有分泌，是一種強效的血管生長因子和血管內皮細胞有絲分裂原［7］;它能通過作用于細胞表面相應受體促進神經干細胞的增殖和分化［8］。其主要生物學作用還有促進創傷愈合與組織修復再生、參與神經再生等。國內外研究［9～11］表明，bFGF作為一種新生血管誘生劑，能局部刺激新生血管的產生;在組織缺血缺氧情況下，其作用更加明顯［12～14］。我們在預實驗中單獨采用bFGF刺激新生血管的形成發現，新生血管維持時間較短，撤藥后逐漸退化。所以本實驗采用bFGF和堿燒傷聯合應用誘導新生血管，bFGF只是在人工角膜植入前后使用，既增加和維持角膜新生血管，又減少了堿燒傷的強度，使角膜度過缺血缺氧的關鍵時期，大大減少了角膜因營養不足導致的溶解變薄和穿孔的發生，提高了人工角膜移植的整體成功率。

本實驗建立了新的角膜新生血管造模方法。此法既能誘導角膜產生較多的新生血管，又能減少炎癥反應，模型眼角膜病理切片證實了應用bFGF可促使角膜有效的瘢痕化;堿燒傷模型兔眼中無一例角膜發生溶解、脫出等嚴重并發癥。說明該建模方法的有效性和可靠性;同時通過對照研究（角膜堿燒傷/角膜堿燒傷后聯合注射bFGF）證實，bFGF對角膜堿燒傷有促進修復作用。以此為基礎，我們可以進一步考察人工角膜能否有長時間移植的潛能，驗證人工角膜替代治療供體角膜的可能。

總之，本研究建立了一種新的角膜新生血管造模方法，這種造模方法能夠模擬角膜病變后的病程和病理生理特征，并能保證人工角膜移植后的正常生長，為將來人工角膜移植的開展奠定了基礎。

［1］遲瑋，王濱生.新型人工角膜的研究［J］.眼外傷職業眼病雜志，2004，26（6）:429-430.

［2］韓旭光，吳欣怡，曲飛，等.角膜縫線與堿燒傷誘導兔角膜新生血管的實驗觀察［J］.山東大學耳鼻喉眼學報，2009，23（2）:79-82.

［3］胡永芳，吳勇杰，劉仲奇.堿性成纖維細胞生長因子與炎癥的關系［J］.國外醫藥:抗生素分冊，2000，21（6）:278-282.

［4］Loughnan MS，Chatzistefanou K，Gonzalez EM，et al.Experimental corneal neovascularisation using sucralfate and basic fibroblast growth factor［J］.Aust N Z J Ophthalmol，1996，24（3）:289-295.

［5］孫康，徐錦堂，陸強，等.人工角膜植入術后EGF和bFGF局部應用的實驗研究［J］.眼外傷職業眼病雜志，2003，25（8）:512-514.

［6］李娜，周偉，杜紅，等.PMMA-硅膠夾持型人工角膜植入堿燒傷兔眼的實驗研究［J］.中華眼外傷職業眼病雜志，2011，33（8）:570-572.

［7］Zittermann SI，Issekutz AC.Basic fibroblast growth factor（bFGF，FGF-2）potentiates leukocyte recruitment to inflammation by enhancing endothelial adhesion molecule expression［J］.Am J Pathol，2006，168（3）:835-846.

［8］李群秀，劉學政，張克儉，等.視網膜細胞聯合bFGF體外誘導大鼠骨髓間充質干細胞向神經樣細胞的分化［J］.中華眼視光學與視覺科學雜志，2010，12（2）:122-123.

［9］孫悅，張士勝，廖華萍，等.bFGF誘導兔眼視網膜下新生血管形成的實驗研究［J］.眼科研究，2006，24（4）:359-363.

［10］Bossard C，Laurell H，Van den Berghe L，et al.Translokin is an intracellular mediator of FGF-2 trafficking［J］.Nat Cell Biol，2003，5（5）:433-439.

［11］Detillieux KA，Sheikh F，Kardami E，et al.Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium［J］.Cardiovasc Res，2003，57（1）:8-19.

［12］崔世軍，張建，俞恒錫，等.VEGF及bFGF基因治療家兔肢體缺血的實驗研究［J］.北京醫學，2007，29（8）:503-504.

［13］劉冰，王豪夫，劉兵，等.大鼠缺血后肢局部應用bFGF對血管新生的影響［J］.齊魯醫學雜志，2009，24（3）:271-273.

［14］袁春燕，趙穎，牛膺筠.堿性成纖維細胞生長因子與視網膜缺血再灌注損傷［J］.青島大學醫學院學報，2003，39（2）:216-217，220.