結(jié)直腸癌組織中MAGE基因啟動(dòng)子去甲基化狀態(tài)與其mRNA表達(dá)的關(guān)系

嚴(yán)茂軍，周懷愉，夏 輝

（1臨沂市腫瘤醫(yī)院，山東 臨沂 276001;2山東大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院）

黑色素瘤抗原（MAGE）基因編碼的抗原肽能夠被自體細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞識(shí)別并殺滅，達(dá)到消除腫瘤細(xì)胞的目的，是腫瘤免疫治療理想的靶抗原［1］。有研究發(fā)現(xiàn)，MAGE基因亞家族在多種惡性腫瘤組織中低表達(dá)限制了其抗原作為腫瘤免疫治療靶點(diǎn)的價(jià)值，而其啟動(dòng)子去甲基化可使MAGE基因重新激活表達(dá)［2，3］，故應(yīng)用甲基化抑制劑可提高其表達(dá)和臨床應(yīng)用價(jià)值。為探討MAGE基因啟動(dòng)子去甲基化對(duì)其基因表達(dá)的影響，我們應(yīng)用RT-PCR、甲基化特異性PCR（MSP）檢測(cè)了結(jié)直腸癌組織中MAGE基因mRNA表達(dá)及其去甲基化狀態(tài)，旨在為以此為靶抗原的免疫治療提供理論依據(jù)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇臨沂市腫瘤醫(yī)院2005年7～11月手術(shù)切除、經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)的原發(fā)性結(jié)直腸腺癌及相鄰正常黏膜（距腫瘤邊緣＞10 cm）組織標(biāo)本各65份。其中患者男44例、女21例，年齡30～78歲、中位年齡55.0歲;結(jié)腸癌27例，直腸癌38例;TNM分期:Ⅰ期8例，Ⅱ期32例，Ⅲ期16例，Ⅳ期9例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47例;所有患者未合并肝肺轉(zhuǎn)移。術(shù)前均未行放化療和免疫治療，術(shù)后均行FOLFOX4方案化療10～12個(gè)周期。

1.2 方法

1.2.1 MAGE-1、MAGE-3 基因啟動(dòng)子 mRNA 檢測(cè)標(biāo)本切除后即刻放入液氮冷卻，后轉(zhuǎn)存于-70℃冰箱。Trizol法提取組織總RNA（Invitrogen，美國(guó)），MAGE-1、MAGE-3基因擴(kuò)增條件及引物參照文獻(xiàn)［4］，GAPDH作內(nèi)參照。以睪丸組織作為陽(yáng)性對(duì)照研究。

1.2.2 MAGE-1、MAGE-3 基因啟動(dòng)子去甲基化檢測(cè) MSP方法檢測(cè)各組織DNA去甲基化。DNA離心柱式抽提試劑盒（江蘇海門(mén)市碧云天生物技術(shù)研究所）提取各組織DNA，EZ DNA甲基化試劑盒-Gold（D5005）（ZYMO RESEARCH，美國(guó)）檢測(cè)各組織去甲基化狀態(tài)。按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。MAGE-1、MAGE-3基因啟動(dòng)子去甲基化引物序列參照文獻(xiàn)［5］。MAGE-1基因啟動(dòng)子去甲基化引物（U）:上游引物:5＇-TGTTAGGAAATATTTGGGTGTTTG-3＇，下游引物:5＇-AACATCTTCCCACAAATAAACC-3＇，擴(kuò)增長(zhǎng)度246 bp;甲基化引物（M）:上游引物:5＇-CGTTAGGAAATATTCGGGTGTTC-3＇，下 游 引 物:5＇-ACGTCTTCCCGCGAATAAAC-3＇，擴(kuò)增長(zhǎng)度 245 bp。MAGE-3基因啟動(dòng)子去甲基化引物（U）:上游引物:5＇-TGTTTGGAATTTAGGGTAGTATTGT-3＇，下 游 引物:5＇-CCATCACTCATTACTCAAAACAAA-3＇;甲基化引物（M）:上游引物:5＇-TTTGTTCGGAATTTAGGGTAGTATC-3＇，下 游 引 物:5＇-GTCGCTCGTTACTCAAAACG-3＇，擴(kuò)增長(zhǎng)度均為 104 bp。修飾后以DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，25 μL反應(yīng)體系:樣品DNA 2 μL，10 × PCR Buffer 2.5 μL，引物各 1 μL，dNTP 2 μL，TaqE 0.2 μL，雙蒸水 16.3 μL。退火溫度50 ℃（M）、50～51.5 ℃（U）30 s，35個(gè)循環(huán)。甲基轉(zhuǎn)移酶處理和未處理的人外周血細(xì)胞DNA作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，自動(dòng)成像儀成像分析。判斷標(biāo)準(zhǔn):僅出現(xiàn)甲基化條帶為高甲基化，同時(shí)出現(xiàn)甲基化和非甲基化條帶為半甲基化，僅出現(xiàn)非甲基化條帶為非甲基化，高甲基化與半甲基化均計(jì)為甲基化陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1MAGE-1、MAGE-3 基因啟動(dòng)子 mRNA 表達(dá)65份結(jié)直腸癌組織中MAGE-1、MAGE-3 mRNA表達(dá)率分別為 18.5%（12/65）、33.9%（22/65），53.8%（35/65）的標(biāo)本至少表達(dá)一種抗原基因;相鄰正常黏膜組織未見(jiàn)表達(dá)。

2.2 MAGE-1、MAGE-3基因啟動(dòng)子去甲基化狀態(tài)65份正常黏膜組織中MAGE-1、MAGE-3基因啟動(dòng)子甲基化率均為100%，但分別有1.5%（1/65）和4.6%（3/65）正常黏膜出現(xiàn)去甲基化;而結(jié)直腸癌組織中MAGE-1基因啟動(dòng)子去甲基化率為29.2%（19/65），MAGE-3基因啟動(dòng)子去甲基化率為47.7%（31/65）。61.5%（40/65）的標(biāo)本至少一種基因存在去甲基化。

2.3 MAGE-1、MAGE-3基因啟動(dòng)子去甲基化狀態(tài)與其mRNA表達(dá)的關(guān)系 65份結(jié)直腸癌組織按去甲基化有無(wú)分為去甲基化組和甲基化組。MAGE-1去甲基化組mRNA表達(dá)率為57.9%（11/19），高于甲基化組的2.2%（1/46）;其去甲基化與mRNA表達(dá)相關(guān)（χ2=24.155，P＜0.05）。MAGE-3 去甲基化組 mRNA表達(dá)率為64.5%（20/31），高于甲基化組的4.3%（2/46）;其去甲基化與mRNA 表達(dá)相關(guān)（χ2=24.899，P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 MAGE-1、MAGE-3基因啟動(dòng)子去甲基化與其mRNA表達(dá)的關(guān)系

3 討論

DNA甲基化可使RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的基因表達(dá)沉默，是抑癌基因失表達(dá)導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制［6，7］。作為癌/睪丸抗原（CTA）家族的 MAGE 基因特異性表達(dá)于除睪丸和卵巢組織以外的各種腫瘤組織，其編碼的腫瘤特異性抗原多肽能夠被自體細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞識(shí)別，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力，成為腫瘤免疫治療的理想靶分子［8］，但尚未發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌特異性較好的靶點(diǎn)。

MAGE-1、MAGE-3基因是具有CTA基因家族共同特性的腫瘤特異性抗原，其表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及惡化相關(guān)，在不同的腫瘤組織中表達(dá)率也各不相同。胃癌、肺癌、肝癌等惡性腫瘤組織中MAGE基因表達(dá)率較高，而其表達(dá)率的高低可能直接影響到免疫治療的效果［1］。同一種腫瘤常有多種MAGE基因亞家族的表達(dá)。如劉芳芳等［9］報(bào)道，結(jié)直腸癌組織中 MAGE-1、MAGE-3基因的表達(dá)率分別為5%、52%，并認(rèn)為MAGE-3基因有可能成為結(jié)直腸癌免疫治療的候選靶點(diǎn)。

已有研究表明，MAGE基因與癌基因以同樣的方式通過(guò)去甲基化而重新表達(dá)［10］。Yanagawa等［11］研究發(fā)現(xiàn)，67例肺癌組織中MAGE-1、MAGE-3基因表達(dá)率分別為29.9%、38.8%，去甲基化率分別為41.8%、46.3%，其中20例 MAGE-1表達(dá)陽(yáng)性組織中18例檢測(cè)到去甲基化，而26例MAGE-3表達(dá)陽(yáng)性組織中24例檢測(cè)到去甲基化。因此，MAGE基因表達(dá)與啟動(dòng)子去甲基化密切相關(guān)，且去甲基化患者較甲基化患者預(yù)后差。檢測(cè)肝癌組織中MAGE-1、MAGE-3基因去甲基化狀態(tài)也得出了相似的結(jié)果，故其對(duì)肝癌的早期診斷具有較高的靈敏性和特異性［4］。本研究發(fā)現(xiàn)，19份結(jié)直腸癌MAGE-1基因去甲基化者11例檢測(cè)到基因表達(dá)，31份結(jié)直腸癌MAGE-3基因去甲基化者20例檢測(cè)到基因表達(dá)，并且其基因表達(dá)與啟動(dòng)子去甲基化密切相關(guān)。提示與其他類(lèi)型腫瘤相似，結(jié)直腸癌組織中 MAGE-1、MAGE-3基因啟動(dòng)子去甲基化可能是基因重新激活表達(dá)的重要調(diào)節(jié)機(jī)制，可發(fā)生在腫瘤的早期、進(jìn)展過(guò)程中，具有較高的腫瘤特異性，檢測(cè)其甲基化模式有可能對(duì)腫瘤的早期診斷、療效觀察和預(yù)后判斷提供有價(jià)值的信息。但并不是所有去甲基化的腫瘤組織均有基因表達(dá)。Kim等［12］觀察32株結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，MAGE-1、MAGE-3分別有59%、66%的表達(dá)，而檢測(cè)到81%的細(xì)胞株出現(xiàn)去甲基化;87例正常黏膜組織中MAGE-1、MAGE-3均出現(xiàn)甲基化，但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)2例和5例擴(kuò)增出去甲基化條帶。本研究也發(fā)現(xiàn)，正常黏膜組織MAGE-1、MAGE-3分別有1、3例出現(xiàn)去甲基化。推測(cè)可能有其他機(jī)制參與了基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。Moreno-Bost等［2］認(rèn)為，不僅 DNA甲基化，可能還有其他機(jī)制參與了MAGE基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，如組蛋白修飾、miRNA。正常黏膜組織存在MAGE基因異常去甲基化，說(shuō)明甲基化改變是結(jié)直腸癌發(fā)生的一個(gè)早期、頻發(fā)的事件。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織中MAGE-1、MAGE-3基因啟動(dòng)子去甲基化可能是基因重新激活表達(dá)的重要調(diào)節(jié)機(jī)制，是結(jié)直腸癌發(fā)生的一個(gè)早期、頻發(fā)的事件，檢測(cè)甲基化模式可能有助于結(jié)直腸癌的早期診斷和預(yù)后判斷。結(jié)直腸癌組織中MAGE-1、MAGE-3基因低表達(dá)可能限制了其抗原作為腫瘤免疫治療靶點(diǎn)的價(jià)值，應(yīng)用甲基化抑制劑可顯著提高其表達(dá)和臨床應(yīng)用價(jià)值［2］。但結(jié)直腸癌組織中有無(wú)特異的低甲基化位點(diǎn)、甲基化與轉(zhuǎn)錄表達(dá)的確切機(jī)制及對(duì)判斷預(yù)后的價(jià)值還不清楚，需要進(jìn)一步的研究和探討。

［1］Bao L，Dunham K，Lucas K.MAGE-A1，MAGE-A3，and NYESO-1 can be upregulated on neuroblastoma cells to facilitate cytotoxic T lymphocyte-mediated tumor cell killing［J］.Cancer Immunol Immunother，2011，60（9）:1299-1307.

［2］Moreno-Bost A，Szmania S，Stone K，et al.Epigenetic modulation of MAGE-A3 antigen expression in multiple myeloma following treatment with the demethylation agent 5-azacitidine and the histone deacetlyase inhibitor MGCD0103［J］.Cytotherapy，2011，13（5）:618-628.

［3］Kim R，Kulkarni P，Hannenhalli S.Derepression of cancer/testis antigens in cancer is associated with distinct patterns of DNA hypomethylation［J］.BMC Cancer，2013，13:144.

［4］LI M，Yuan YH，Han Y，et al.Expression profile of cancer-testis genes in 121 human colorectal cancer tissue and adjacent normal tissue［J］.Clin Cancer Res，2005，11（5）:1809-1814.

［5］Qiu G，F(xiàn)ang J，He Y.5＇CpG island methylation analysis identifies the MAGE-A1 and MAGE-A3 genes as potential markers of HCC［J］.Clin Biochem，2006，39（3）:259-266.

［6］Guo C，Ren F，Wang D，et al.RUNX3 is inactivated by promoter hypermethylation in malignant transformation of ovarian endometriosis［J］.Oncol Rep，2014，32（6）:2580-2588.

［7］Nikolaidis G，Raji OY，Markopoulou S，et al.DNA methylation biomarkers offer improved diagnostic efficiency in lung cancer［J］.Cancer Res，2012，72（22）:5692-5701.

［8］Batchu RB，Gruzdyn O，Potti RB，et al.MAGE-A3 with cell-penetrating domain as an efficient therapeutic cancer vaccine［J］.JAMA Surg，2014，149（5）:451-457.

［9］劉芳芳，葉穎江，王杉.多種MAGE基因在結(jié)直腸癌中的表達(dá)和意義［J］.中普通外科雜志，2010，25（2）:126-129.

［10］Moreno-Bost A，Szmania S，Stone K，et al.Epigenetic modulation of MAGE-A3 antigen expression in multiple myeloma following treatment with the demethylation agent 5-azacitidine and the histone deacetlyase inhibitor MGCD0103［J］.Cytotherapy，2011，13（5）:618-628.

［11］Yanagawa N，Tamura G，Oizumi H，et al.MAGE expressions mediated by demethylation of MAGE promoters induce progression of non-small cell lung cancer［J］.Anticancer Res，2011，31（1）:171-175.

［12］Kim KH，Choi JS，Kim IJ，et al.Promoter hypomethylation and reactivation of MAGE-A1 and MAGE-A3 genes in colorectal cancer cell lines and cancer tissues［J］.World J Gastroenterol，2006，12（35）:5651-5657.