HPLC法測定青果丸中黃芩苷的含量

王亦存（龍門縣人民醫(yī)院，廣東惠州 516800）

青果丸系中藥成方制劑[1-2]，由青果、金銀花、黃芩、北豆根、麥冬、玄參、白芍和桔梗8味中藥組成，具有清熱利咽、消腫止痛的功效，對于咽喉腫痛、失音聲啞、口干舌燥、肺燥、咳嗽具有較好的療效。方中黃芩的主要有效成分黃芩苷具有清熱解毒、抗炎、利膽、降壓、利尿、鎮(zhèn)靜、保肝、抗菌等多方面的藥理作用[3-6]。但是，目前相關(guān)文獻(xiàn)僅報(bào)道了對青果丸中綠原酸和芍藥苷進(jìn)行含量測定[1，7]，并無對黃芩苷的含量進(jìn)行測定的報(bào)道。因此，本試驗(yàn)采用高效液相色譜（HPLC）法測定了該制劑中的有效成分黃芩苷的含量。

1 材料

P680A型HPLC儀，包含SCL-6B系統(tǒng)控制儀、LC-9A泵、SIL-6B自動進(jìn)樣器、C-R4A數(shù)據(jù)處理機(jī)等（美國Dionex公司）；UV-2450紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；AB265-S型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

黃芩苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110715-200514，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.1%）；青果丸（吉林某制藥廠，批號：120106、1210425、120718，規(guī)格：8g/袋）；甲醇為色譜純，乙醇、磷酸等試劑均為分析純，水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[8-10]

色譜柱：Agilent TC-C18（150mm×4.60mm，5μm）；流動相：甲醇-水-0.02mol/L磷酸（45∶55∶0.2，V/V/V）；流速：1.0 ml/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量10μl；檢測波長：278nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷對照品適量，置于50ml量瓶中，加適量70%乙醇溶液溶解并稀釋至刻度，制成每1ml含0.1mg的溶液，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備[11]取樣品2g，研碎，取約l g，精密稱定，加硅藻土0.5g，加入70%乙醇溶液40ml，加熱回流2h，放冷，濾過，濾液置于100ml量瓶中，用少量70%乙醇溶液分次洗滌容器和殘?jiān)匆簽V入同一量瓶中，加70%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液 取青果丸中除黃芩外的其他藥材，按制備工藝制成陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下制備方法制成陰性對照溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

分別取“2.2”項(xiàng)下對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，陰性對照在黃芩苷色譜峰處未發(fā)現(xiàn)吸收峰，對黃芩苷的出峰沒有干擾，表明該方法的專屬性良好。

2.4 線性關(guān)系考察

精密移取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液適量，分別稀釋制成每1ml含黃芩苷10、20、50、100、150、200μg的系列對照品溶液。精密吸取上述系列對照品溶液各10μl，注入HPLC儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜。以黃芩苷質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程y＝15807x+19683（r＝0.9999，n＝6）。結(jié)果表明，黃芩苷檢測質(zhì)量濃度在10～200μg/ml范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。結(jié)果，黃芩苷峰面積的RSD＝0.67%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號：1210425）適量，分別于放置0、4、8、12、20、24h時(shí)精密吸取10μl注入HPLC儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定峰面積。結(jié)果，黃芩苷峰面積的RSD＝0.83%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號：1210425）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定并計(jì)算含量。結(jié)果，黃芩苷的平均含量為7.87mg/g，RSD＝0.96%，表明本方法的重復(fù)性較好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品（批號：1210425）適量，共9份，分別按80%、100%、120%的比例精密加入“2.2.1”項(xiàng)下的對照品溶液適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

2.9 樣品含量測定

取3批樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定黃芩苷的峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果，批號為120106、1210425、120718的樣品平均含量分別為7.48、7.87、8.06μg/g。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

筆者利用二極管陣列檢測器在200～400nm波長范圍內(nèi)掃描對照品溶液的吸收光譜，發(fā)現(xiàn)黃芩苷在278nm波長處有最大吸收，靈敏度高，干擾較少，所以最終選擇278nm為本試驗(yàn)的檢測波長。

3.2 流動相的選擇

本試驗(yàn)先以甲醇-磷酸二氫鉀為流動相，考察了不同比例的出峰情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)峰形拖尾均嚴(yán)重，改為加入0.02mol/L磷酸溶液后峰形明顯改善，表明在甲醇-水-0.02mol/L磷酸（45∶55∶0.2，V/V/V）的條件下，能夠較好地分離樣品中的主峰與雜質(zhì)峰，且峰形對稱，保留時(shí)間短，靈敏度高。方法學(xué)驗(yàn)證表明，其精密度、穩(wěn)定性、回收率和重復(fù)性均能滿足定量分析的要求。

3.3 研究的價(jià)值

從本試驗(yàn)所測青果丸中黃芩苷的含量可知，產(chǎn)品中黃芩苷含量變化較大。筆者認(rèn)為，藥材的產(chǎn)地及采收季節(jié)不同可能導(dǎo)致不同批次產(chǎn)品中黃芩苷的含量不同。故建議廠家加強(qiáng)對原料藥材的質(zhì)量監(jiān)控，并制定相應(yīng)的指標(biāo)。

綜上所述，本方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于青果丸中黃芩苷的含量測定。

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