金櫻子總黃酮對大鼠全血黏度和血小板聚集的影響

陳傳平，方士英，彭 成，陳乃東

（1.皖西衛生職業學院，安徽 六安237000；2.皖西學院生物與制藥工程學院，安徽 六安237012）

金櫻子（Rasa Laevigata Michc）系薔薇科薔薇屬常綠灌木的果實，在我國南方大部分地區均有分布，其中安徽大別山區資源尤為豐富［1］，作為一種傳統中藥，可以治療神經衰弱、高血壓及慢性胃炎等多種疾病［2］。黃酮類化合物廣泛存在于植物中，具有多種生理活性，如抗氧化、抗腫瘤、清除自由基、抗血小板凝集等［3］。研究表明，金櫻子中所含的黃酮類化合物，具有一定的藥理活性［4］，但對抗血栓作用研究尚未見報道。本實驗初步探討金櫻子總黃酮對大鼠血粘度的影響及抗血小板聚集作用，為進一步研究金櫻子藥理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

金櫻子：產地為皖六安市金寨縣，采摘于2011年10月，自然曬干。

1.1.2 主要儀器

精密電子天平（XR125SM），瑞士Precisa公司；旋轉蒸發器（RE-52），上海青蒲滬西儀器廠；冷凍干燥機（FD-1），北京博醫康公司；高效液相色譜（1525），美國 WATERS公司；全自動血液流變儀（SA6000）、血小板聚集測試儀（SC2000），北京賽科希德科技發展有限公司。

1.1.3 主要試劑

復方丹參片，天津飛鷹制藥有限公司，批號：20120805；阿司匹林，陜西白鹿制藥有限公司，批號：20130223；二磷酸腺苷（ADP）、血小板活化因子（PAF），Sigma公司；其余試劑均為AR。

1.1.4 實驗動物

健康Wistar大鼠，雌雄各半，體重200g～250 g，由皖南醫學院實驗動物研究中心提供，合格證號：醫動字第12-2512。

1.2 方法

1.2.1 金櫻子總黃酮的制備

金櫻子原料→洗凈，去籽90℃烘干（48h）→粉碎，過40目篩→石油醚回流脫脂（60℃，2h）→揮干溶媒，置錐形瓶中，加入60%乙醇（v：v），60℃回流提取2.5h，過濾，濾液減壓濃縮后冷凍干燥，得金櫻子粗黃酮；粗黃酮采用AB-8型大孔吸附樹脂精制，得精制金櫻子總黃酮（TFR）［5］。

1.2.2 TFR黃酮含量的測定

為了準確測定TFR中黃酮含量，采用HPLCUV測定各組分的峰值比，具體條件為：色譜柱：Hypersil ODS2柱（4.6mm×250mm），檢測波長：365nm，流速：1mL／min，柱溫為室溫，進樣量：10 uL，分析時間：26min。

1.2.3 血瘀造模及大鼠全血黏度檢測［6］

1.2.3.1 動物分組

大鼠經實驗室適應性喂養1周后，隨機分為5組：空白對照組、丹參對照組及TFR低、中、高劑量給藥組，每組8只，雌雄各半。

1.2.3.2 飼喂藥物

分組后正常飼喂，自由飲水。每天下午2點給藥組按總黃酮／大鼠體重低（0.06g／kg）、中（0.12g／kg）、高（0.24g／kg）劑量ig不同濃度藥物，對照組ig等體積生理鹽水，丹參對照組按0.05g／kg劑量ig，連續2周。

1.2.3.3 血黏度檢測

第15d早晨按0.006mL／kg劑量在大鼠皮下注射腎上腺素，2h后浸入冰水5min，4h后相同劑量再注射一次，禁食，次日腹主動脈抽血4mL，枸櫞酸鈉抗凝，用血液流變儀測定全血高切、中切及低切血粘度。

1.2.4 體外抗血小板聚集活性測試［7］

1.2.4.1 實驗藥物準備

精密稱取TFR，用少量60%乙醇溶解，再用生理鹽水稀釋為濃度為1.2.3.2法溶液，同法配制濃度為10mg／L的阿司匹林溶液為對照組。

1.2.4.2 實驗動物準備

正常飼喂大鼠5只，雌雄各半，禁食12h后，各從腹主動脈抽血5mL，共5份，每份用檸檬酸鈉混勻抗凝，1 000r／min離心15min，取上清液，為富含血小板血漿 （PRP），余下血液以3 000r／min離心10 min，為貧血小板血漿（PPP）。用PPP調整PRP中血小板濃度為500×109／L左右備用。

1.2.4.3 血小板聚集率測定

在血小板凝集儀中，以PPP為對照，在PRP中分別加入二甲基亞砜（DMSO）作為陰性參照物，各加入上述不同濃度待測液0.5mL，37℃溫育3min后分別加入二磷酸腺苷（ADP，終濃度1.05mol／L）、血小板活化因子（PAF，終濃度為0.4mg／L），測定血小板最大聚集率及抑制率，抑制率（%）＝（空白組聚集率-給藥組聚集率）／空白組聚集率×%。

1.2.5 統計學處理

所有數據用SPSS11.0for Windows數據包處理計量資料，用均數±標準差表示，組間經方差分析和t檢驗。

2 結果與分析

2.1 金櫻子總黃酮含量測定結果

圖1為HPLC-UV法測定色譜流出曲線，可看出金櫻子總黃酮組分中共含6個特征峰，各峰放大結果見圖2。黃酮類化合物在200～400nm左右有連續雙峰［8］，通過圖2可以判斷金櫻子總黃酮組分中含3個黃酮特征峰（＃1、＃3和＃4），＃2、＃5和＃6不是黃酮。同時計算黃酮峰總面積占總峰面積的74.32%，在進樣量和響應值都相同的情況下，峰面積比與含量比等值，即總黃酮含量為74.32%。

圖1 金櫻子總黃酮HPLC-UV檢測峰結果（365nm）

圖2 各峰放大結果

2.2 TFR對大鼠全血黏度的影響

大鼠全血黏度檢測結果見表1。與空白對照組比較，TFR低劑量組中的全血黏度中、高切沒有顯著性差異（P＞0.05），但丹參組，TFR中、高劑量組全血黏度低、中、高切都有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01），且顯著性與TFR有一定的劑量依賴性關系，同時可看出TFR中劑量組（120mg／kg）與丹參組（50mg／kg）對大鼠全血血黏度的改善效果接近，說明TFR對大鼠血黏度有一定的降低作用。

表1 不同處理組大鼠血粘度檢測結果（s，n＝8）

表1 不同處理組大鼠血粘度檢測結果（s，n＝8）

注：與空白對照組比較 ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01）

血黏度／η／mPa／s 22.31±0.26 9.97±0.32 6.49±0.29丹參組 50 15.62±0.58＊＊ 6.99±0.51＊＊ 5.11±0.53＊＊TFR低劑量組 60 19.24±0.52＊ 9.33±0.61 6.18±0.50 TFR中劑量組 120 15.33±0.27＊＊ 7.82±0.39＊ 6.02±0.29＊TFR高劑量組 240 11.28±0.34＊＊ 6.15±0.42＊＊ 5.20±0.35低切 中切 高切空白對照組組 別 劑量／mg／kg-＊＊

2.3 TFR體外抗血小板聚集活性測試結果

TFR體外抗血小板聚集活性測試結果見表2。TFR低劑量組對ADP誘導的大鼠血小板聚集有一定的抑制作用（P＜0.05），但對PAF誘導的血小板聚集抑制作用無顯著性差異（P＞0.05），阿司匹林及TFR中、高劑量組對由ADP、PAF誘導的大鼠血小板聚集均有明顯的抑制作用（P＜0.01），且劑量越大，抑制效果越明顯。

表2 TFR體外抗血小板聚集活性測試結果（s，n＝5）

表2 TFR體外抗血小板聚集活性測試結果（s，n＝5）

注：與空白對照組比較 ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01）

組 別 劑量mg／kg ADP PAF最大聚集率／% 抑制率／% 最大聚集率／% 抑制率／%空白對照組-36.4 58.5±2.8 - 60.2±3.5 -阿司匹林組 10 32.3±4.1＊＊ 44.8 35.6±6.1＊＊ 40.9 TFR低劑量組 60 51.2±2.2＊ 12.5 57.6±6.5 0.04 TFR中劑量組 120 40.4±3.7＊＊ 30.9 42.6±3.8＊＊ 29.2 TFR高劑量組 240 30.7±5.2＊＊ 47.5 38.3±2.9＊＊

3 討論

臨床研究表明，血液黏度是血液在流動時內摩擦力大小的反應，黏度越大，在血管中流動的阻力就越大，血液流動的速度也就越慢，最終影響微循環及組織、器官的血流量，導致疾病的發生及血栓形成［9］。血液黏度的測定，在缺血性和出血性腦中風的鑒別診斷、療效觀察、預后判斷有重要的意義。出血性腦中風時，以全血黏度降低最明顯，在缺血性腦中風時，全血黏度升高，是造成缺血性血管病的主要原因。血小板可以和內皮細胞及白細胞一起誘發動脈粥樣硬化的形成，并參與動脈粥樣硬化晚期并發癥的形成［10］。因此，尋找有效的抗血栓藥物成為當前研究的熱點，因而，近年來關于黃酮類化合物在治療冠心病、動脈粥樣硬化方面的作用研究更加廣泛而深入。

藥理研究表明，天然來源的黃酮類化合物具有的可通過選擇性結合到血小板形成的血栓壁上來發揮抗血栓作用，導致已形成的血小板血栓分離，例如黃酮醇、兒茶素等可降低氧化型LDL-C和減少載脂蛋白有缺陷的大鼠動脈粥樣硬化形成；攝取富含花色素的葡萄籽提取液，可減輕服用膽固醇兔的動脈粥樣硬化，并且能同時降血清膽固醇酯和主動脈丙二醛水平；黃芩黃素通過抗平滑肌細胞增殖作用而抑制動脈粥樣硬化等［11］。從本實驗結果看，TFR能夠明顯地改善急性血瘀模型大鼠全血黏度，在一定程度上能夠抑制ADP、PAF誘導的大鼠血小板聚集，初步研究表明，TFR在抑制血栓形成方面有一定的價值。圖1表明，總黃酮中主要有3種組分，其活性機制是某種單一組分還是3種組分的協同，本課題組將做進一步探討。

［1］余宏，陳傳平.安徽省大別山山區金櫻子資源開發利用現狀調查［J］.安徽農學通報，2012，18（12）：124-124.

［2］閔俊，李燕燕，余華.金櫻子的化學成分、藥理作用及臨床應用研究進展［J］.環球中醫藥，2008（2）：16-18.

［3］Huang，W，Ochiai，H.，Zhang，X.Y，et al.Introducing N-glycans into Natural Products through a Chemoenzymatic Approach ［J］.Carbohyd Res，2008，343（17）：2903-2913.

［4］陳傳平，彭成，方士英，等.不同提取工藝對金櫻子黃酮體外抗氧化活性的影響［J］.中國林副特產，2013（6）：5-7.

［5］周守標，陳乃東，胡金蓉，等.春花胡枝子黃酮大孔樹脂純化工藝研究及純化前后抗氧化性變化比較［J］.中國實驗方劑學雜志，2006，12（12）：4-7.

［6］陳民利，壽旗楊，潘永民，等.冠心片對氣滯血瘀大鼠抗血小板聚集和保護血管內皮作用［J］.中國臨床藥理學與治療學，2005，10（5）：586-589.

［7］吳兆軍，李順來，丁忠仁，等.N6-烷基-2-烷氧基腺苷化合物的合成及抗血小板凝集活性［J］.有機化學，2011，10（31）：1618-1623.

［8］張東方，周美環，孟荃，等.HPLC-UV擬合紫外圖譜識別黃芩中黃酮有效部位及其含量測定［J］.遼寧中醫學院學報，2005，3（7）：266-267.

［9］Saeed SA，Rasheed H.Calcium Dependent Synergistic Interaction of Platelet Activating Factor and Epinephrine in Human Platelet Aggregation ［J］.Acta Pharmacol Sin，2003，24（1）：30-34.

［10］唐寧.血栓形成及抗組織因子藥物研究進展［J］.中國老年學雜志，2013，1（33）：222-224.

［11］吳兵，陳新，張長春，等.天然產物中黃酮類化合物抗血小板作用研究進展［J］.武漢工業學院學報，2010，3（29）：53-56.