響應面法優化皖西粗老綠茶茶多糖提取工藝

何曉梅，沈濤濤，陳壯壯，張 穎

（1.皖西學院生物與制藥工程學院，安徽 六安237012；2.植物細胞工程安徽省工程技術研究中心，安徽 六安237012）

皖西地處大別山腹地，是我國重要的江北茶區，境內氣候溫和，雨量充沛，植被條件良好，森林覆蓋率高，土壤多屬山地黃棕壤，有機質豐富，結構良好，所產茶葉內含物豐富。名優茶品種繁多，有六安瓜片、霍山黃芽、舒城小蘭花、金寨翠眉、霍山菊花茶、小峴春等。而名優茶產量只占茶葉總產量的20%左右，中低檔茶葉和粗老茶葉得不到充分利用，造成極大浪費。茶多糖是一類從茶葉中提取出來的多糖類化合物，具有增強免疫力、降血脂、降血糖、抗輻射、抗凝血、抗血栓等功效，具有多種藥理作用［1］。據研究，茶葉越粗老，其茶多糖含量越高［2-3］。目前對皖西粗老綠茶茶多糖提取研究未見報道，若能從皖西粗老綠茶中提取茶多糖并制成保健品，對于皖西粗老茶葉的綜合利用具有較大的經濟價值。

本研究以皖西粗老綠茶為原料，在單因素試驗的基礎上，采用響應面法進一步優化茶多糖的提取工藝，以期得到最佳提取工藝參數，為皖西茶葉茶多糖的進一步開發利用提供依據和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮粗老綠茶，安徽一笑堂茶業有限公司提供。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要儀器

智能型電熱恒溫鼓風干燥箱，電子分析天平（1／1000），SHJ-A4水浴磁力攪拌器，RE-2000E 旋轉蒸發器，SHB-Ⅲ型臺式循環水式多用真空泵，GL-21M大型冷凍離心機，TU-1901紫外可見分光光度計。

1.2.2 主要試劑

葡萄糖標準品、苯酚、濃硫酸，均為國產分析純，水為二次蒸餾水。

1.2.2.1 葡萄糖標準溶液的配制

精密稱取經105℃干燥至恒重的葡萄糖標準品25.00mg，置于25mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用。

1.2.2.2 6%苯酚溶液的配制

取重蒸酚80.00g加蒸餾水20mL溶解，搖勻，置棕色瓶于4℃冰箱保存，臨用前用80%苯酚溶液加蒸餾水稀釋配制而成。

1.3 試驗方法

1.3.1 綠茶茶多糖的浸提

將含有綠茶粉末的濾紙包置于索氏提取器中，用石油醚回流脫脂，晾干。然后準確稱取一定質量綠茶粉末于三角燒瓶中，按一定水茶比加入蒸餾水，在一定溫度下浸提一定時間，抽濾，離心，測定浸提液中茶多糖含量。

1.3.2 茶多糖提取率計算

采用苯酚—硫酸法制備葡萄糖標準曲線［4］。精密量取葡萄糖標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL置于20mL具塞試管中，各加蒸餾水至2.0mL，依次加入6%苯酚溶液1.0mL，濃硫酸5.0mL，搖勻，靜置20min后測OD490nm值，制作標準曲線（圖1）。由圖1得回歸曲線方程為：y＝15.668x，R2＝0.9994。

圖1 葡萄糖標準曲線

茶多糖提取率計算：取茶多糖提取液1mL同標準曲線制備操作步驟，測OD490nm值，根據標準曲線回歸方程計算樣品濃度（C樣品）。根據下列公式計算茶多糖提取率（%）。

茶多糖提取率（%）＝ ［（C樣品×提取液總體積×換算因子［5］）／（茶樣質量×103）］×100。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 浸提時間對茶多糖提取率的影響

準確稱取5.000g脫脂綠茶粉末，選取水茶比為30∶1，浸提溫度為80℃，浸提時間為1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h（每個水平進行3組平行實驗，以下同），按照1.3.1的方法進行實驗，結果如圖2。

由圖2可知，隨著浸提時間的延長，茶多糖提取率呈上升趨勢，但增加幅度不大。考慮到浸提時間越長，茶葉中其他水溶性成分越容易擴散出來，另外耗費能源也越多，故選用浸提時間為2h。

2.1.2 浸提溫度對茶多糖提取率的影響

準確稱取5.000g脫脂綠茶粉末，選取水茶比為30∶1，浸提時間為2h，浸提溫度為50℃、60℃、70℃、80℃、90℃，按照1.3.1的方法進行實驗，結果如圖3。

圖2 浸提時間對茶多糖提取率的影響

圖3 浸提溫度對茶多糖提取率的影響

由圖3可知，浸提溫度在50～80℃時，隨著浸提溫度的升高，茶多糖的得率增加明顯；超過80℃時，隨著溫度的升高，茶多糖得率增加幅度減緩。考慮到高溫可能會破壞茶多糖的結構，影響其生物活性，故采用浸提溫度為80℃。

2.1.3 水茶比對茶多糖提取率的影響

準確稱取5.000g脫脂綠茶粉末，選取浸提溫度為80℃，浸提時間為2h，水茶比為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1，按照1.3.1的方法進行實驗，結果如圖4。

圖4 水茶比對茶多糖提取率的影響

由圖4可知，隨著水茶比的增大，茶多糖提取率逐漸增加，其中水茶比從10∶1增加到20∶1時，茶多糖提取率增加明顯。隨著水茶比例的增加，提取液過濾、濃縮時間大大增加，考慮到節約時間和成本，故采用水茶比為20∶1。

2.1.4 浸提次數對茶多糖提取率的影響

準確稱取5.000g脫脂綠茶粉末，選取浸提溫度為80℃，浸提時間為2h，水茶比為20∶1，按照1.3.1的方法進行實驗，結果如圖5。

圖5 浸提次數對茶多糖提取率的影響

由圖5可知，隨著浸提次數的增加，茶多糖總提取率增加，但第2至第4次浸提液中茶多糖含量都較少，所以在后續優化實驗中，只進行一次浸提。

2.2 二次響應面法實驗結果與分析

根據Box-Behnken Design試驗設計原理，綜合單因素實驗結果，選取浸提時間、浸提溫度、水茶比作為考察因素，浸提液中茶多糖提取率作為因變量，采用Box-Behnken設計三因素三水平的響應面分析［6］。Box-Behnken設計的方案及結果見表1和表2。

表1 Box-Behnken設計實驗因素及編碼水平

利用Design-Expert軟件對表2的試驗結果進行分析，得到茶多糖提取率Y與各自變量關系的二次多項回歸方程為：Y＝4.65＋0.14A＋0.36B＋0.19C-0.067AB-0.037AC＋0.091BC-0.15A2-0.18B2＋0.056C2

由回歸方程的方差分析（表3）可知，實驗所選用模型P值為0.0003（P＜0.01），極顯著。而且 A、B、C、A2、B2各項都表現顯著或極顯著，說明回歸模型具有較好的擬合度，能較好地反映茶多糖的浸提率與各選擇因素不同水平之間的量效關系。

表2 Box-Behnken試驗設計與結果

表3 回歸方程的方差分析

利用Design-Expert軟件對茶多糖得率進行計算機模擬，得到各因素取最優值（浸提時間2.06h、浸提溫度90℃、水茶比30∶1）后的響應所能取得的最大值為5.171%，與實驗條件（浸提時間2.0h、浸提溫度90℃、水茶比30∶1）所得實驗值5.081%相差較小，因此Design-Expert軟件所得的最優條件可以作為茶多糖浸提的條件。

3 結論

以水為提取溶劑，在單因素實驗的基礎上，通過響應面實驗和Design-Expert分析軟件確定茶多糖的最佳浸提條件為浸提時間2.06h、浸提溫度90℃、水茶比30∶1、浸提1次，茶多糖最高浸提率為5.171%。

實驗所得浸提溫度為90℃，與參考文獻［7］相比偏高，較高的溫度是否影響茶多糖的結構和活性有待進一步研究。

［1］陳義勇，竇祥龍，黃友如，等.響應面法優化超聲-微波協同輔助提取茶多糖工藝［J］.食品科學，2012，33（4）：100-103.

［2］陳建國，胡欣，梅松.茶葉中茶多糖的提取和測定方法［J］.中國衛生檢驗雜志，2004，14（4）：432-433.

［3］汪東風，謝曉鳳，王澤農，等.粗老茶中的多糖含量及其保健作用［J］.茶葉科學，1994，14（1）：73-74.

［4］傅博強，謝明勇，聶少平，等.茶葉中多糖含量的測定［J］.食品科學，2001，22（11）：69-73.

［5］張惟杰.復合多糖生化研究技術［M］.上海：上海科技出版社，1987.

［6］Giovinni M.Response Surface Methodology and Product Optimization［J］.Food Technology，1982，37（9）：41-45.

［7］原龍，范泳，徐文芳.綠茶中提取茶多糖最佳工藝的優化［J］.食品工業科技，2010，31（5）：255-256.