9個(gè)不同居群虎耳草光合特性及有效成分含量分析

賀安娜，滕 攀

(懷化學(xué)院1.生命科學(xué)系;2.民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3.湘西藥用植物與民族植物學(xué)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 懷化 418008)

虎耳草 (Saxifraga stoloniferaCurt.)又名石荷葉、金線吊芙蓉、老虎耳等.生于海拔400-4 500米的林下、灌叢、草甸和蔭濕巖隙[1].全草入藥，具有清熱解毒、祛濕消腫、涼血止血的功效，可用于止咳抗炎等[2].虎耳草含量較高的成分主要有虎耳草素、有機(jī)酸類、黃酮類[3，4].丁家欣用HPLC 法測(cè)定不同產(chǎn)地及不同收季虎耳草中的巖白菜素的含量，發(fā)現(xiàn)湖北洪山所產(chǎn)虎耳草含量最高[5]，黃志金等對(duì)虎耳草不同部位巖白菜素含量進(jìn)行了測(cè)定，研究表明葉中巖白菜素的含量最高[6].近年有研究報(bào)道，虎耳草有抑制前列腺癌的作用[7]，對(duì)虎耳草有效成分提取及抗癌活性的研究逐步增多[8，9].

植物的種內(nèi)或種間關(guān)系目前主要通過(guò)形態(tài)性狀[10]、分子標(biāo)記[11]等技術(shù)手段進(jìn)行聚類分析.曾苗春等[12]對(duì)不同居群的虎耳草葉的顏色、葉背的顏色等形態(tài)特征進(jìn)行了比較，通過(guò)歐式距離聚類分析，得出不同居群虎耳草的親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近.植物生態(tài)型之間在外觀形狀上不一定有明顯的區(qū)分界限，它們更多的是表現(xiàn)在生理生化特性上的差異[13]，植物因素如葉片氣孔導(dǎo)度、氣孔阻力等是植物長(zhǎng)期適應(yīng)多變的環(huán)境和土壤而形成的一類自身調(diào)節(jié)因素[14].本文測(cè)定虎耳草不同居群光合特性及有效成分含量，并對(duì)其進(jìn)行相關(guān)性分析，為篩選虎耳草優(yōu)異種質(zhì)資源提供依據(jù)，也為虎耳草的高效栽培提供參考.

1 試劑與材料

巖白菜素對(duì)照品和沒(méi)食子酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品鑒定所)，純度≥98%.甲醇為色譜純，水為純凈水，其余試劑為分析純.

不同居群虎耳草材料的來(lái)源地及移栽時(shí)間，詳見(jiàn)表1.各居群虎耳草均栽種于盆中，盆上口徑為22 cm，底部直徑15 cm，高20 cm，置于懷化學(xué)院生物園樹(shù)蔭下，透光率約為35%.

表1 9個(gè)不同居群虎耳草來(lái)源

2 方法

2.1 氣體交換參數(shù)測(cè)定

于2014年4月中旬天氣晴朗無(wú)風(fēng)日的上午9:00—11:00，采用Li-6400 便攜式光合測(cè)定系統(tǒng)(美國(guó)LI-COR公司)，選擇不同居群虎耳草的健壯植株并長(zhǎng)勢(shì)一致的正常功能葉10 片進(jìn)行測(cè)定，取平均值.記錄其凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導(dǎo)度(Gs)及胞間CO2濃度(Ci)等.

2.2 葉綠素含量測(cè)定

在完成不同居群虎耳草的光合參數(shù)測(cè)定后，隨即采取相應(yīng)的正常功能葉片，用95%乙醇提取葉綠素，采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津UV-2550)進(jìn)行測(cè)定.

2.3 巖白菜素和沒(méi)食子酸含量測(cè)定

分別采集虎耳草春葉和秋葉樣品，進(jìn)行干燥處理至恒重，粉碎并通過(guò)120 目篩，備用.精確稱取1.0 g虎耳草粉末，用甲醇提取，料液比為1∶25 (g∶mL)，裝入50 mL 錐形瓶中，超聲波提取35 min，重復(fù)提取一次.所得濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至約5 mL，用甲醇定容至25 mL，經(jīng)0.22 μm 針孔濾膜過(guò)濾.含量測(cè)定采用LC-20AT 高效液相色譜儀(日本島津)進(jìn)行，色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18 (150 mm ×4.6 mm，5 μm).流動(dòng)相:甲醇-0.1%磷酸溶液(73∶29);流速:1.02 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng):272 nm;柱溫25℃;進(jìn)樣量:20 μL.按外標(biāo)法以峰面積積分值計(jì)算巖白菜素和沒(méi)食子酸的含量.

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所測(cè)定結(jié)果取平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤，利用Excel 及SPSS16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與相關(guān)性分析.

3 結(jié)果與分析

3.1 氣體交換參數(shù)比較

不同居群虎耳草的氣體交換參數(shù)存在較大差異，如其凈光合速率(Pn)變化范圍為4.12-6.85 μmol·m-2·s-1(表2)，其中Pn 最高的居群為2號(hào)居群，最低的為5號(hào)居群;蒸騰速率最高的居群則是9號(hào)居群，為4.95 mmol·m-2·s-1;水分利用率最高的居群為7號(hào)居群，為2.66 mol·m-2·s-1;胞間二氧化碳濃度差異較小.

表2 9個(gè)虎耳草居群氣體交換參數(shù)比較

3.2 葉綠素含量比較

不同居群虎耳草的葉綠素含量差異較大，其中2號(hào)居群葉綠素a 含量最高，為0.7481.01 mg·g-1，總?cè)~綠素含量也最高，為1.01 mg·g-1(表3)，說(shuō)明2號(hào)居群有較高光合能力，葉綠素含量最低的為7號(hào)居群，僅0.345 mg·g-1.葉綠素a/b的值在3 左右，最高的為5號(hào)居群，為3.29，最小的是2號(hào)居群，僅2.09.

表3 9個(gè)虎耳草居群葉綠素含量比較

3.3 巖白菜素及沒(méi)食子酸含量比較

9個(gè)不同居群虎耳草中，巖白菜素和沒(méi)食子酸含量變化不一致(表4)，巖白菜素含量稍高于沒(méi)食子酸含量.巖白菜素含量最高的為2號(hào)居群，為3.94 mg·g-1，最低的7號(hào)居群僅1.48 mg·g-1;沒(méi)食子酸含量最高的是3號(hào)居群，為1.91 mg·g-1，最低的也是7號(hào)居群，僅0.512 mg·g-1.

表4 9個(gè)虎耳草居群巖白菜素及沒(méi)食子酸含量比較

3.4 光合參數(shù)與有效成分的相關(guān)性分析

將9個(gè)居群虎耳草的光合參數(shù)及有效成分含量進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)凈光合速率與氣孔導(dǎo)度、總?cè)~綠素含量及巖白菜素含量都呈正相關(guān)，其中與總?cè)~綠素含量達(dá)極顯著正相關(guān)，與巖白菜素含量顯著正相關(guān)(表4);蒸騰速率與氣孔導(dǎo)度的相關(guān)系數(shù)為0.862，達(dá)極顯著水平.巖白菜素含量與凈光合速率及葉綠素含量正相關(guān)，其中與凈光合速率的相關(guān)性達(dá)顯著水平，與總?cè)~綠素含量達(dá)極顯著水平;沒(méi)食子酸算含量則與各個(gè)參數(shù)的相關(guān)性都不顯著.

表5 光合參數(shù)與有效成分的相關(guān)系數(shù)表

4 小結(jié)與討論

由于本研究的9個(gè)居群虎耳草均經(jīng)過(guò)2～3年時(shí)間的移栽處理，基本排除了原生境因素對(duì)不同居群虎耳草光合特性及有效成分含量比較的干擾，這種差異的造成應(yīng)屬居群本身遺傳差異導(dǎo)致.9個(gè)虎耳草居群從外部形態(tài)到光合生理及有效成分含量均存在較大差異，其中湖南祁陽(yáng)居群的凈光合速率最大，但其葉綠素含量并不是最高的，說(shuō)明葉綠素含量并不是影響光合作用的唯一因素.湖南中方仙人谷居群葉綠素a/b值最小，表明該虎耳草葉片對(duì)光強(qiáng)適應(yīng)程度最不敏感.

藥用植物有效成分積累與其生理生態(tài)因子的關(guān)系密切.賈光林等對(duì)人參中人參皂苷與生態(tài)因子的相關(guān)性分析結(jié)果表明，熱量因子對(duì)人參皂苷活性成分的累積起主要作用[15].本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同光溫種植條件下，虎耳草巖白菜素及沒(méi)食子酸含量與光合有效輻射呈正相關(guān)[16].綠色植物通過(guò)光合作用產(chǎn)生的初生代謝產(chǎn)物，既是植物生命活動(dòng)必需的化合物，又是植物次生代謝產(chǎn)物的前體，并且所有旺盛生長(zhǎng)的細(xì)胞內(nèi)都存在著次生代謝物的不斷合成和轉(zhuǎn)化[17].本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)9個(gè)居群虎耳草的光合參數(shù)及有效成分含量相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，巖白菜素含量與凈光合速率顯著正相關(guān)，與總?cè)~綠素含量相關(guān)系數(shù)為0.837，達(dá)極顯著正相關(guān)，但沒(méi)食子酸含量與光合參數(shù)的相關(guān)性均不顯著，其原因可能是這兩種成分在虎耳草植株內(nèi)合成途徑不同所導(dǎo)致.

[1]中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志(第34 (2)卷)[M].北京:科學(xué)出版社，2005:75.

[2]覃容貴，龍慶德，范菊娣，等.炮制對(duì)虎耳草中巖白菜素及其止咳抗炎作用的影響[J].中成藥，2013，35(5):1027-1030.

[3]羅厚慰，吳葆金，陳節(jié)庵，等.虎耳草有效成分的研究[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1988，19 (1):1-3.

[4]Chen Z，Liu Y-M，Yang S，et al.Studies on the chemical constituents and anticancer activity of Saxifraga stolonifera (L.) Meeb[J].Bioorganic ＆Medicinal Chemistry.2008 (16):1337-1344.

[5]丁家欣，張秋海，張玲，等.HPLC 法測(cè)定不同產(chǎn)地與采收期虎耳草中巖白菜素的含量[J].中國(guó)中藥雜志，2002，27 (10):792-793.

[6]黃志金，趙楊，趙超，等.虎耳草根、莖、葉中巖白菜素的含量研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(2):86-88.

[7]周欣，陳華國(guó)，黃志金，等.虎耳草抗前列腺癌生物活性部位篩選研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2013，29(6):867-870.

[8]周美，陳華國(guó)，先春，等.虎耳草乙酸乙酯部位高效液相色譜指紋圖譜研究[J].中國(guó)中藥雜志，2013，38(7):1026-1029.

[9]周欣，陳華國(guó)，黃志金，等.響應(yīng)面法優(yōu)選虎耳草抗前列腺癌活性部位提取工藝[J].中草藥，2013，44(13):1768-1773.

[10]張新華，夏念和.含笑屬(木蘭科)植物花粉形態(tài)及其系統(tǒng)學(xué)意義[J].廣西植物，2008，28 (3):311-316.

[11]全妙華，歐立軍，佘朝文，等.中國(guó)石蒜屬種間關(guān)系的trnH-psbA 序列分析[J].園藝學(xué)報(bào)，2011，38(8):1589-1594.

[12]曾苗春，左浪柱，賀安娜.不同居群虎耳草形態(tài)性狀遺傳多樣性研究[J].中國(guó)民族醫(yī)藥雜志，2013(9):38-39.

[13]李六林，楊佩芳，田彩芳.新紅星蘋(píng)果不同枝類葉片中葉綠素含量的變化[J].果樹(shù)科學(xué)，1999，16(1):78-80.

[14]張錦春，趙明，張應(yīng)昌，等.灌溉植被梭梭、白刺光合蒸騰特性及影響因素分析[J].西北植物學(xué)報(bào)，2005，25 (1):70-76.

[15]賈光林，黃林芳，索風(fēng)梅，等.人參藥材中人參皂苷與生態(tài)因子的相關(guān)性及人參生態(tài)區(qū)劃[J].植物生態(tài)學(xué)報(bào)，2012，36 (4):302-312.

[16]賀安娜，歐立軍，李勝華，等.虎耳草不同光溫條件下光合特性及有效成分含量的相關(guān)性分析[J].植物研究，2013，33 (5):587-592.

[17]McMullen M D，Byrne P F，Snook M E.et al.Quantitative trait loci and metabolic pathways[J].Proc Natl Acad Sci USA，1998 (95):1996-2000.