茶葉中β-櫻草糖苷酶及其底物的研究進展

項麗慧，林馥茗，孫威江，2，*

(1.福建農林大學園藝學院，福建福州350002;2.福建農林大學安溪茶學院，福建泉州362400)

β-櫻草糖苷酶(β-primeverosidase，6-O-β-D-xylopranosyl-β-D-glucopyranosides)，具有基團專一性，特異性水解β-櫻草糖苷。對茶葉而言，其主要作用是通過水解萜醇類糖苷香氣前體，使茶葉呈現出天然花香，并且在茶葉的防御機制中起到一定的積極效應。

早在 1925 年，Bridel M［1］在報春花 (Primula officinalis)上發現了β-櫻草糖苷酶具有水解β-櫻草糖苷的作用。之后，Guo W等［2］從茶樹葉片中分離β-櫻草糖苷酶，并提出該酶對紅茶和烏龍茶香氣有影響。在梔子花中，也有檢測出β-櫻草糖苷酶的活性［3］。在許多植物中，色素、藥理成分等生理活性物質均以β-櫻草糖苷的形式存在，如海巴戟天［4］、杜仲［5］、蘋果［6］、白土茯苓［7］等植物。Plouvier［8］研究認為，β-櫻草糖苷酶主要存在于含有β-櫻草糖苷的高等植物體內。由于β-櫻草糖苷在植物體內可穩定存在，越來越多的β-櫻草糖苷被檢出，可推斷β-櫻草糖苷酶在植物體中分布較為廣泛，但由于在其他植物中β-櫻草糖苷酶的功能不顯著或突出，對β-櫻草糖苷酶的研究暫局限于茶樹和相關深加工行業。

在茶葉醇類糖苷水解途徑［9］中，起到關鍵作用的糖苷類酶主要為β-櫻草糖苷酶、β-葡萄糖苷酶以及β-半乳糖苷酶［10-11］，相比 β-櫻草糖苷酶，其他酶的研究報道較多［12-16］。β-櫻草糖苷酶對茶葉的香氣機理、抗病防御體系、食品加工、化工、制藥有著重要實際意義，因此本文對β-櫻草糖苷酶酶學特性、提取純化方法、活性測定方法、分子生物學及其底物種類和變化規律等方面進行綜述，并探討了今后β-櫻草糖苷酶的應用前景。

1 β-櫻草糖苷酶

β-櫻草糖苷酶，分子量 61ku，等電點 9.4，當pH5～7、溫度50℃以下時酶活性穩定，最適 pH為5.0，溫度 50℃時活性最高［17］。

1.1 專一性

一般而言，糖苷酶對糖苷配基的特異性比對糖殘基的特異性差，β-櫻草糖苷酶也是如此，表現為基團專一性，對苷鍵與糖基的立體結構有很強的特異性。Guo W等［18］研究發現β-櫻草糖苷酶對(S)-芳樟醇-β-櫻草糖苷、苯甲醇-β-櫻草糖苷、苯甲醇-6-O-β-D-呋喃芹菜糖基-β-D-葡萄吡喃糖苷水解活性很高，對(R)-芳樟醇-β-二糖苷、香葉醇-6-O-α-L-阿拉伯呋喃糖基-β-二糖苷-D-葡萄吡喃糖苷水解活性低。Matsumura S［19］以銀鹽法合成的β-櫻草糖苷、甾菜糖苷為底物研究了β-櫻草糖苷酶的專一性，認為它對配糖體和糖基均具有嚴格的特異性。Ijima Y等［20］以從茶葉中提取的雙糖苷為底物分別與β-櫻草糖苷酶進行反應，結果發現β-櫻草糖苷酶的底物專一性是對含有1-6糖苷鍵的櫻草糖苷的相對專一性，這與 Matsumura S的觀點不同。Wei-Wei Han等［21］利用β-葡萄糖苷酶的已知結構，構建了β-櫻草糖苷酶的3D模型，并且找到了結合位點，發現只有β-櫻草糖苷可與其對接。以上研究中，早期均是通過水解反應結果作為依據，判斷β-櫻草糖苷酶的專一性，而Wei-Wei Han從分子動力學角度印證了β-櫻草糖苷酶的基團專一性。

1.2 底物

1.2.1 β-櫻草糖苷的分布 β-櫻草糖苷作為茶葉的重要香氣前體物質，受到人們極大的關注。1993年，Guo W 等［22］證實香葉醇在茶葉中主要以香葉醇-β-D-櫻草糖苷形式存在，芳樟醇主要以芳樟醇-β-D-櫻草糖苷的形式存在，驗證了茶樹中不單有葡萄糖苷，還有β-櫻草糖苷的存在。Wang D等［23］合成了26多種糖苷，采用三氟乙酰化衍生方法結合GC-MS對茶葉中的糖苷進行定性和定量的分析，發現茶葉中存在11種β-櫻草糖苷和10種β-葡萄糖苷，并且鮮葉中β-櫻草糖苷的含量是β-葡萄糖苷的3倍。近年，采用Amberlite XAD-2作為填料進行柱層析分離茶葉 β-櫻草糖苷，Yano M 等［24-31］陸續分離了藪北種、毛蟹、水仙、櫧葉種中的糖苷類香氣前體，結合GC-MS技術，發現順-3-己烯醇、芳樟醇及其氧化物(Ⅰ、Ⅱ)、香葉醇、水楊酸甲酯、苯甲醇和2-苯乙醇為茶葉中主要苷元，除了苯甲醇，其余均以β-櫻草糖苷形式存在，只有順-3-己烯醇和苯甲醇存在β-葡萄糖苷，這與Wang D等［23］的研究結果不同。由以上研究結果可看出，較β-葡萄糖苷而言，結合在β-櫻草糖苷的苷元更多，說明β-櫻草糖苷在茶樹中是更為重要的前體物質。

1.2.2 在茶葉中的變化規律 對不同季節、不同加工過程的茶樹鮮葉中糖苷類香氣前體進行研究，發現各種前體在苷元組成上是一致［32-34］。張正竹等［32］研究發現，櫧葉種春茶的香葉醇糖苷的含量很高，秋茶的芳香族醇和脂肪族醇糖苷含量明顯增長，但單萜烯醇糖苷含量下降。由此可看出，鮮葉的糖苷類香氣前體物質是成品茶香氣的季節差異性成因之一。Wang D等［33］發現在紅茶揉捻工序中 β-櫻草糖苷明顯減少，經發酵工序后幾乎完全消失，而葡萄糖苷含量保持不變，說明β-櫻草糖苷是紅茶香氣主要前體物質，但與紅茶加工不同的是，在烏龍茶曬青過程中，大多數糖苷含量上升，成茶的糖苷達到最高水平［34］。這有可能是二者加工過程中環境溫濕度以及工藝不同而導致，具體原因有待深入研究。

2 提取純化及酶活測定方法

經提取純化后，可獲得較高純度的β-櫻草糖苷酶，使β-櫻草糖苷酶具有最大的催化活性。Ogawa K等［35］將茶鮮葉經勻漿處理制成丙酮粉，用40%～80%的硫酸銨沉淀酶蛋白，經透析后，用CM-TOyopearl 650M柱層析，得到糖苷酶三個組分，其中Ⅱ組分組經膜超濾脫鹽濃縮，再使用單SHR5/5離子交換柱進行快速蛋白液相色譜分離，得到Ⅱ1、Ⅱ2兩個組分，Ⅱ1經凝膠色譜和SDS-PAGE分析，即為純化后的β-櫻草糖苷酶。現階段的提取純化方法多僅限于實驗室的操作，為今后實現β-櫻草糖苷酶的工業化發展，日本天野酶株式會社［36］獲得與β-櫻草糖苷酶有著相似功能的二糖苷酶(來自青霉(Pencicillium)以及相應的基因，該新型二糖苷酶分子量(40±5)ku，最適pH為4.5、等電點4.3。該酶可水解包括櫻草苷在內的類似二糖糖苷，相較從煙曲霉產生的二糖苷酶，安全性高，酶活性高，耐熱性好，在各種食品、藥品、準藥品領域可廣泛應用。

β-櫻草糖苷酶的活力表現為催化水解反應的速度，酶催化的反應速度可以用單位時間內底物的消耗量或產物的積累量來表示。測定β-櫻草糖苷酶活性主要采用色原底物法，由于市面上暫無4-甲基傘形糖基β-櫻草糖苷或pNP-β-櫻草糖苷出售，需在木糖苷酶的催化下通過轉糖基作用合成。Ma S J等［37-38］將木糖和pNP-葡萄糖苷合成的pNP-β-櫻草糖苷，作為β-櫻草糖苷酶反應底物，采用pNP(對硝基苯酚)法對β-櫻草糖苷酶活性進行測定。董尚勝、童啟慶［3］用木糖和4-甲基傘形酮β-葡萄糖苷制成4-甲基傘形酮β-櫻草糖苷(4-MUβ-Pri)，通過4-MU法(檢測波長為448nm)測定梔子花的β-櫻草糖苷酶的活性。目前β-櫻草糖苷酶活的測定方法沒有統一的標準，致使不同實驗得到β-櫻草糖苷酶酶活無法進行比較分析，需盡快確立科學的方法。

3 分子生物學研究

基因工程技術可讓人們有可能生產出大量的β-櫻草糖苷酶，以研究其特性，并應用于食品工業。2002年 Mizutani等［17］根據藪北中純化到的 β-櫻草糖苷酶的部分氨基酸序列，獲得了編碼β-櫻草糖苷酶的cDNA克隆(序列號:AB088027)，全長1729bp，編碼507個氨基酸(28個氨基酸的前導肽和479個氨基酸殘基的成熟蛋白質)，與多種植物上的β-葡糖苷酶存在50%～60%同源性。費月［39］將β-櫻草糖苷酶的ORF框片段，插入原核表達載體pET-32a，轉化至表達菌株Rosetta(DE3)pLysS中，經IPTG誘導表達出融合蛋白。

根據已登錄的基因，采用實時定量PCR技術，趙麗萍等［40］實驗結果表明β-櫻草糖苷酶基因在一芽一葉表達量很低，一芽二葉最高(2.49×106copy·μL-1)，而后隨著成熟度的增加而降低，β-葡萄糖苷酶基因的表達量明顯高于β-櫻草糖苷酶基因，一芽二葉和一芽三葉新梢中兩個基因的表達量均較高，這恰好符合烏龍茶采摘標準，驗證了成品茶花香高低與鮮葉中β-櫻草糖苷酶的表達有一定相關性。張廣輝［41］利用RT-PCR和GC-MS研究了UV-B處理對β-櫻草糖苷酶與β-葡萄糖苷酶基因表達和離體茶樹葉片香氣成分的影響，結果表明短時間UV-B處理可以刺激糖苷水解酶的基因活性，而使更多的香氣前體被水解并釋放出香氣成分。2014年，Jiang SHI等［42］研究表明，經茉莉酸甲酯處理過的龍井43茶樹，葉片中的β-櫻草糖苷酶表達水平增加3倍，極顯著高于空白對照。綜上所述，不同葉位、UV-B以及茉莉酸甲酯處理對β-櫻草糖苷酶表達量均有所影響，這為研究茶葉香氣形成的分子機理提供了重要的依據。

4 在抗病防御體系中的作用

茶樹中的β-櫻草糖苷酶對茶葉品質有影響，同時在抗病防御體系中也起到重大作用。在β-櫻草糖苷酶催化產生的物質中，3-己烯醇分別具有對害蟲的毒性和吸引害蟲天敵的直接或間接防御作用［43-44］，還有水楊酸甲酯是誘導多種防御反應的信號物質［45］。戚麗等的研究結果顯示，當β-櫻草糖苷在濃度為5.0～25.0mg/mL時，對茶樹葉部茶炭疽病菌、茶云紋葉枯病菌、茶輪斑病菌和茶赤葉斑病菌均具有明顯的抑制作用，糖苷類香氣前體組分濃度與抗菌活性呈正相關［46-47］。

綜上，具有抗病防御作用的物質是以穩定的β-櫻草糖苷形式貯存在茶樹葉片中的，當遇到蟲害及病菌侵染時，在β-櫻草糖苷酶或外源病原菌水解酶的作用下，水解并釋放出苷元，從而抵御外界的侵染。

5 問題與展望

在茶葉加工中，要通過人工施用外源β-櫻草糖苷酶實現對香氣品質的調控，難度大，不可控因素多，從分子角度研究茶樹β-櫻草糖苷酶，并運用到茶樹育種中，能避免上述難題，同時還可以選育出抗逆性強的優質品種。值得關注的是，由于獲得反應底物的難度較大，現今暫無統一的β-櫻草糖苷酶活性的測定方法，各個研究組的結果不盡相同，難以進行比較分析，但隨著更快速、準確的活性測定方法的確定，并能進一步研究在不同環境條件β-櫻草糖苷酶活和表達量的變化，尋找酶、香氣物質之間的相關性，這有利于發現茶葉加工關鍵控制點，獲得較佳的香氣物質組成配比和含量。

目前，人們已基本掌握β-櫻草糖苷酶的酶學特性，并運用基因工程法制備β-櫻草糖苷酶，對其底物的分布和變化研究也取得了可喜的成果。一方面，β-櫻草糖苷酶可用于調節香氣成分的提取效率，如茶飲料、化妝品、香水、調味料、藥品、木工制品等產品，還能對植物材料、食物和飲料等的色度起到改善作用。另一方面，β-櫻草糖苷酶水解反應的產物——櫻草糖，已從茶葉中分離獲得［48］，可作為糖尿病、肝病患者日常食用的能量來源，同時具有保濕、抗氧化功能等特點，有望取代海藻糖用于化妝品行業。隨著β-櫻草糖苷酶、β-櫻草糖苷及櫻草糖的研究進展加深加快，將在茶葉加工、食品深加工及化工行業等得到更廣泛的應用。

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