羧甲基殼聚糖溫敏凝膠對NIH3T3細胞在病變牙根面附著和增殖的影響*

王 丹，彭 偉，李明珠，陳乃玲，穆 玉

1)河北聯合大學口腔醫學院 唐山063000 2)廈門市口腔醫院牙體牙髓病科 廈門361000

△女，1980年11月生，碩士，主治醫師，講師，研究方向:牙周病的防治，E-mail:wang_dan1955@163．com

牙石和牙菌斑是牙周病最主要的局部刺激因素。齦下菌斑產生的大量內毒素會侵入表層牙骨質，即使通過齦下刮治和根面平整治療后，牙周膜細胞在牙根面的附著和生長仍會受到抑制，妨礙新纖維性附著的形成。如何有效去除毒素并形成具有良好生物相容性的根面成為牙周病治療的重點。成纖維細胞是牙周膜中最常見的細胞，其不斷形成新纖維，對牙周組織的修復十分重要。羧甲基殼聚糖(carboxymethyl chitosan，CMCS)是一種新型的殼聚糖衍生物，具有良好的生物相容性。溫敏凝膠是近年來出現的一類新型高分子智能材料，作為細胞及藥物載體支架在組織工程的研究領域已經取得了顯著進展。該研究中作者以和成纖維細胞生物學性質極為相似的小鼠胚胎成纖維細胞NIH3T3［1］作為研究靶細胞，觀察CMCS 溫敏凝膠應用于根面處理后的患牙根面后NIH3T3 細胞的附著和增殖情況，評價其在牙周新附著形成過程中是否有促進作用。

1 材料與方法

1．1 材料 NIH3T3 細胞購自天津賽爾生物技術有限公司;DMEM 細胞培養基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶購自天津血液研究所;MTT、PBS、DMSO、乙二胺四乙酸(EDTA)、甘油磷酸鈉購自美國Sigma 公司;CMCS 購自青島海普生物有限公司。

1．2 樣本的選擇 收集因晚期牙周炎需拔除的炎癥患牙60 顆，患者年齡35～60歲?；佳罉藴?帶有可見性牙石，探診深度≥5 mm，附著喪失≥6 mm，牙槽骨吸收至少到根尖1/3，近半年未行刮治術和根面平整治療，無全身疾病史。拔牙前記錄牙周袋頂的位置，拔除中確保不損傷根面，拔出后立即用無菌生理鹽水沖凈，放于新鮮配制的PBS 中，－20℃保存備用。

1．3 CMCS 浸提液的制備 將取代度為0．3 的CMCS 消毒后稱取2．25 g 加入到45 mL 0．1 ×10－3mol/L 的無菌鹽酸溶液中，在(23 ±1)℃條件下溶解2 h，用G3 玻璃砂芯漏斗濾去未溶物，量取9 mL CMCS 濾液備用。稱取0．6 g 消毒后的甘油磷酸鈉溶解于1 mL 無菌超純水中，緩慢滴加到CMCS 濾液中，再繼續攪拌20 min 使二者均勻混合，即得CMCS/甘油磷酸鈉配合物溶液。將裝有CMCS/甘油磷酸鈉配合物溶液的試管置于30～70℃水浴中，達到初始凝膠化溫度后，恒溫一定時間，得到水凝膠。再將CMCS 溫敏凝膠按0．002 g/mL 的標準，37℃條件下放入到浸提介質(含體積分數10%FBS 的DMEM 完全培養基)中，4℃冰箱保存備用。

1．4 牙根片的制備 60 顆牙分為5組，按照分組情況分別采用手動刮治器械或超聲器械進行刮治及根面平整，以去除肉眼可見的菌斑和牙石。于標記處和結締組織附著處之間選擇較平的根面，在有冷水冷卻的條件下使用高速切割機縱行切下牙根表層，從髓腔側向牙骨質側方向均勻磨除牙根片至1 mm 厚，保證牙骨質側完好，制備出5 mm×5 mm×1 mm 大小的牙根片60個，放入雙抗溶液(青霉素、鏈霉素濃度均為100 U/mL)中浸泡24 h，再在無菌條件下放入培養皿內置于紫外燈下4 h，隨即放入加有雙抗的PBS 中24 h，4℃保存備用。

1．5 實驗分組 60個牙根片分為5組，每組12個。A組:超聲刮治+EDTA 處理3 min +CMCS 浸提液涂擦牙根表面5 min;B組:超聲刮治+ EDTA處理3 min +無菌生理鹽水涂擦牙根表面5 min;C組:手動刮治+EDTA 處理3 min +CMCS 浸提液涂擦牙根表面5 min;D組:手動刮治+ EDTA 處理3 min+無菌生理鹽水涂擦牙根表面5 min;E組(對照組):EDTA 處理3 min +無菌生理鹽水涂擦牙根表面5 min。處理后的牙根片分別放入3 塊24 孔板內，牙骨質面朝上，每組4個孔，每孔加入1 mL 含體積分數10%FBS 的培養基，置于37℃、體積分數5%CO2培養箱中2 h。

1．6 NIH3T3 細胞在根面附著和增殖的觀察 取出24 孔板，吸棄孔內的培養液。另取生長良好的小鼠NIH3T3 細胞，經2．5 g/L 的胰蛋白酶消化，104r/min 離心5 min 后棄上清液，再加入含有體積分數10%FBS 和雙抗的DMEM 培養基反復吹打，制備成單細胞懸液，調整細胞密度為1 ×105mL－1，接種于24 孔板內，每孔1 mL，放回培養箱中，使牙根片與NIH3T3 共同孵育，以求細胞附著生長于牙根片上，16 h 后，取1 塊24 孔板，吸棄孔內液體，將牙根片上附著的細胞以胰蛋白酶消化后制備細胞懸液，進行細胞計數;共孵育24 h，再取1 板，制備成單細胞懸液后以1 ×105mL－1的細胞密度接種于96 孔板內，每組6 孔，待細胞貼壁后MTT 法檢測OD 值;共孵育72 h，取出最后1 塊24 孔板，處理同24 h。

1．7 統計學處理 采用SPSS 17．0 處理數據。孵育24 和72 h 時5組細胞OD 值的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q 檢驗，檢驗水準α=0．05。

2 結果

NIH3T3 細胞在牙根片上孵育16 h 后，A、B、C、D、E組細胞數分別為(1．53 ±0．06)×105、(0．79 ±0．05)×105、(1．25 ±0．06)×105、(0．45 ±0．07)×105，E組細胞數量少于A、B、C、D組。共孵育24、72 h 時各組細胞OD 值比較見表1。

表1 牙片上各組NIH3T3 細胞的OD 值比較(n=4)

3 討論

臨床上治療牙周病的常用方法是在潔治術后使用更加精細的器械進行齦下刮治和根面平整，常用器械一般分為手用和超聲兩種。丁一等［2］對手動和超聲方法刮治后的病變牙根進行了掃描電鏡觀察，結果證實，兩種方法都是去除根面感染物質的有效方法。該實驗亦證實應用手動還是超聲處理根面對成纖維細胞在病變根面的附著生長及增殖的影響不大。EDTA 作為效果較好、副作用較小的根面處理劑，在實驗中保證了干預條件一致，使所有牙根片表面盡量去除化學玷污層，暴露膠原，有利于細胞的附著生長。

CMCS 是一類生物學性質安全、穩定的新型生物材料。莊昭霞和李巖等［3-4］經體外細胞實驗證明CMCS 對牙周膜細胞具有良好的促進增殖和骨向分化作用;此外，CMCS 還具有抑制口腔內重要厭氧菌生長［5］的優點。將CMCS 與甘油磷酸鈉互配制成CMCS 溫敏凝膠，當溫度達到35～37℃時可迅速變成水凝膠，通過注射的方式可將其置于需要的部位，且降解產物無毒副作用，因此不需二次手術取出植入材料，符合牙周病治療的應用要求，操作簡單，前景廣闊。

作者前期的實驗［6］已證實，CMCS 溫敏凝膠具有促進NIH3T3 細胞增殖和分化的作用。該研究中作者進一步觀察了它是否有利于NIH3T3 細胞在根面處理后的病變牙根片上附著和增殖。結果顯示，培養初期(16 h)NIH3T3 細胞在各組牙根片上已經開始附著生長，刮治和根面平整過的牙根片上生長的細胞較未處理的牙根片上細胞多，說明有效的刮治利于細胞的附著生長;MTT 法結果證實，在培養24、72 h 時，進行根面處理和使用CMCS 溫敏凝膠的各組細胞數多于對照組;而超聲或者手動的方法處理根面后，細胞的附著和增殖情況并無明顯差異，說明二者都是有效的根面處理方法，但是聯合使用CMCS 溫敏凝膠浸提液后，細胞的增殖情況優于聯合使用無菌生理鹽水，提示在有效的根面平整后使用CMCS 溫敏凝膠可以促進細胞增殖，CMCS 溫敏凝膠在牙周組織再生領域有著廣泛的應用前景。

［1］武影，張秀麗，束蓉．EDTA 對人牙周膜細胞在病變根面附著和增殖影響［J］．實用口腔醫學雜志，2005，21(4):554

［2］丁一，胡琳，劉國良．超聲和手用器械齦下潔治后牙根面的掃描電鏡觀察［J］．牙體牙髓牙周病學雜志，1997，7(1):38

［3］莊昭霞，林志勇，曹金芳．殼聚糖-羧甲基殼聚糖膜的生物相容性研究［J］．上海口腔醫學，2003，12(5):362

［4］李巖．甲殼素及衍生物對NIH3T3 細胞和人牙周膜細胞增殖的影響［D］．石家莊:河北醫科大學，2005．

［5］唐濤，薛毅，信玉華，等．羧甲基殼聚糖對口腔重要厭氧菌的抑菌性能評價［J］．中國微生態學雜志，2003，15(6):337

［6］陳乃玲，穆玉，李明珠，等．羧甲基殼聚糖溫敏凝膠對NIH3T3 細胞增殖、骨化分化的影響［J］．鄭州大學學報:醫學版，2014，49(4):540