依那普利預(yù)處理對大鼠心肌組織解偶聯(lián)蛋白2和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶表達(dá)的影響

康丹丹，湯建民

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科 鄭州450014

解偶聯(lián)蛋白2(uncoupling protein-2，UCP2)是位于線粒體內(nèi)膜上的載體蛋白，介導(dǎo)氧化磷酸化與ATP 合成解偶聯(lián)，抑制活性氧的生成［1］，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激，對抗心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)是NO 合成的限速酶，內(nèi)皮型NOS(epidermal nitric oxide synthase，eNOS)和誘導(dǎo)型NOS(induced nitric oxide synthase，iNOS)是與MIRI 有關(guān)的主要NOS 亞型。隨著研究的不斷深入，近年來提出了藥物預(yù)適應(yīng)(pharmacological ischemic preconditioning，PIP)這一概念。國內(nèi)外研究［2-4］證實(shí)，藥物預(yù)處理對MIRI 具有保護(hù)作用。目前關(guān)于UCP2 的研究大多基于缺血缺氧刺激，有關(guān)PIP 與UCP2 的研究則較少，而有關(guān)iNOS 與PIP 的研究則罕見報(bào)道。該實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠缺血再灌注損傷模型，檢測心肌組織UCP2 及iNOS 的表達(dá)，進(jìn)一步探討依那普利預(yù)處理對心肌的保護(hù)機(jī)制，為藥物治療提供線索及依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康成年SD 雄性大鼠35只，購于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重250～300 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d。將大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(Sham組)7只、缺血再灌注組(IR組)14只、依那普利預(yù)處理組(PIP組)14只。PIP組給予依那普利10 mg/(kg·d)灌胃，余給予生理鹽水2 mL/d 灌胃。預(yù)處理1 周后制作大鼠MIRI 模型，獲得Sham組6只、IR組8只、PIP組9只。

1．2 試劑 依那普利片(10 mg)由揚(yáng)子江有限公司提供，RT 試劑盒、PCR 試劑盒、Marker 由Transgene 公司提供，ECL 試劑盒由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供，小鼠抗大鼠UCP2 抗體、羊抗大鼠iNOS 抗體、GAPDH 抗體由Santa Cruz 公司提供，二抗由Zymed 公司提供。

1．3 儀器 小型動(dòng)物呼吸機(jī)(型號:Inspira)由北京創(chuàng)博環(huán)球生物科技有限公司提供，小動(dòng)物心電圖機(jī)(型號:SBP-2000)由上海茂生生物科技發(fā)展有限公司提供，D-140 圖像記錄分析系統(tǒng)由大連競邁儀器有限公司提供，PCR 擴(kuò)增儀、EP 管由Eppendorf 公司提供。

1．4 模型建立及心肌標(biāo)本采集 用體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛按3 mL/kg 腹腔注射，麻醉成功后，固定大鼠，連接心電圖機(jī)于四肢皮下。氣管切開插管，呼吸機(jī)輔助呼吸，潮氣量20 mL/kg，頻率60～70次/min。開胸暴露心臟，剪開心包，擠出心臟，于左心耳根部冠狀動(dòng)脈起始處用5 號絲線穿過該動(dòng)脈。Sham組只穿線不結(jié)扎，余2組將一帶有凹槽的細(xì)乳膠管墊于血管與結(jié)扎線之間，結(jié)扎30 min，剪開結(jié)扎線，取出細(xì)乳膠管，關(guān)胸后再灌注120 min。模型成功標(biāo)準(zhǔn):結(jié)扎線遠(yuǎn)端的缺血心肌變白，顏色變暗，心電圖上QRS 波增寬增高［5］或伴ST 段抬高，證實(shí)左前降支結(jié)扎成功。再灌注后缺血部位心肌顏色恢復(fù)，QRS 波振幅減低，抬高的ST 段回落，證實(shí)結(jié)扎血管再灌注成功。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后摘取心臟，獲取左室缺血區(qū)心肌組織，分為2 份，用預(yù)冷的PBS 鹽水洗凈殘血，1 份在液氮中迅速冷凍，2 份均存放于－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1．5 血清磷酸激酶(CK)活性和丙二醛(MDA)含量測定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后采取2 mL 心室血，4 000 r/min離心10 min 后取血清，全自動(dòng)生化分析儀測定血清CK 活性及MDA 含量。

1．6 心肌組織UCP2 和iNOS mRNA 檢測 UCP2上游引物5'-TCCTGGCAGGTAGCACCA-3'，下游引物5'-CCCGAAGGCAGAAGTGAAG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為311 bp。iNOS 上游引物5'-GCTGTCTGACCCTCA TTTT-3'，下游引物5'-GCTGTCTGACCCTCATTTT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為180 bp。GAPDH 上游引物5'-CCACGGCAAGTTCAACGGCACA-3'，下游引物5'-GCGGCATGTCAGATCCACAACG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為589 bp。取心肌組織100 mg，用Trizol 法提取組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以2 μL cDNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán);72℃總延伸6 min。取5 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，EB 染色。目的基因的相對表達(dá)量以目的基因和GAPDH 條帶的灰度值之比來表示。

1．7 心肌組織UCP2 和iNOS 蛋白檢測 按每20 mg 心肌組織加100～200 μL 的比例加入蛋白裂解液，4 000 r/min 離心5 min，取上清液獲得組織蛋白。蛋白經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0．1%的麗春紅染色，剪下帶有Marker 條帶的膜和濾紙，在轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡30 min。除去氣泡后合上夾子，倒入轉(zhuǎn)移槽中，100 V 電壓轉(zhuǎn)移80 min，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉TBST 封閉2 h。將一抗按1 ∶1 000 稀釋加入膜上，4℃搖床過夜孵育，TBST 沖洗3次，分別為15、10、5 min。將膜與二抗按1∶4 000 稀釋，37℃恒溫床孵育45 min，TBST 沖洗3次，每次5 min。用ECL 顯色，將膠片掃描后用Bandscan 5．0 進(jìn)行灰度分析。

1．8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17．0 分析數(shù)據(jù)。各組CK 活性、MDA 含量、UCP2 和iNOS mRNA 與蛋白表達(dá)的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 血清CK 活性和MDA 含量 與Sham組相比，IR組及PIP組血清CK 和MDA 含量升高，而PIP組較IR組降低(表1)。

表1 各組大鼠血清CK 活性、MDA 含量比較

2．2 心肌組織UCP2 表達(dá) 與Sham組相比，IR組及PIP組心肌組織UCP2 蛋白、mRNA 表達(dá)升高;PIP組較IR組降低。見圖1、2 和表2。

圖1 各組大鼠心肌組織UCP2 及iNOS 蛋白的表達(dá)

圖2 各組大鼠心肌組織UCP2 mRNA 的表達(dá)

2．3 心肌組織iNOS 表達(dá) 與Sham組相比，IR組及PIP組心肌組織iNOS 蛋白、mRNA 表達(dá)升高;PIP組較IR組進(jìn)一步升高。見圖1、3 和表2。

表2 各組大鼠心肌組織UCP2、iNOS 蛋白及mRNA 表達(dá)的比較

圖3 各組大鼠心肌組織iNOS mRNA 的表達(dá)

3 討論

氧自由基爆發(fā)［6］是引起MIRI 的重要作用機(jī)制之一，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧可以上調(diào)及激活UCP2的表達(dá)。Krauss 等［7］把超氧化物加入分離的線粒體中，發(fā)現(xiàn)其激活UCP2 介導(dǎo)的質(zhì)子漏。UCP2 通過解偶聯(lián)作用抑制活性氧的生成，被譽(yù)為體內(nèi)抗氧化因子。該實(shí)驗(yàn)觀察到IR組代表氧化應(yīng)激引起細(xì)胞損傷［8］的指標(biāo)MDA 含量升高，同時(shí)UCP2 表達(dá)也升高;與IR組相比，PIP組血清MDA 含量、CK 活性降低，UCP2 表達(dá)降低，說明氧化應(yīng)激減弱，心肌細(xì)胞損傷減少，證明依那普利具有對抗MIRI 的作用。依那普利預(yù)處理的確切作用機(jī)制尚不清楚，可能與其抑制AngⅡ誘發(fā)的活性氧生成有關(guān)［9］。依那普利抑制UCP2 表達(dá)上調(diào)，是通過減少缺血區(qū)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激起作用。

MIRI 引起內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，舒血管物質(zhì)與縮血管物質(zhì)比例失調(diào)。內(nèi)源性NO 是一類舒血管活性物質(zhì)，其合成受iNOS 的調(diào)節(jié)。生理?xiàng)l件下iNOS 無活性，正常組織也較少表達(dá)。在缺血缺氧、炎癥刺激等病理?xiàng)l件下則開始表達(dá)［10］，催化生成NO 參與MIRI的調(diào)節(jié)，NO 發(fā)揮心肌毒性或心肌保護(hù)的作用主要取決于NO 的釋放量。研究［11］表明緩激肽可激活NOS促進(jìn)NO 合成，并通過NO-cGMP 途徑或其他途徑實(shí)現(xiàn)心肌保護(hù)作用，更有學(xué)者［12］認(rèn)為某些心血管疾病的發(fā)生與緩激肽受體調(diào)節(jié)有關(guān)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IR組iNOS 表達(dá)升高，證明缺血缺氧刺激可誘導(dǎo)其表達(dá)。給予依那普利預(yù)處理后其活性進(jìn)一步升高，同時(shí)反映心肌損傷的指標(biāo)CK 活性降低，說明依那普利通過增強(qiáng)iNOS 活性減輕MIRI。這一作用機(jī)制可能與其抑制AngⅡ生成，減少緩激肽降解，保留其更多生物活性，促進(jìn)iNOS 產(chǎn)生更多NO 有關(guān)。

總之，依那普利預(yù)處理可能通過下調(diào)UCP2、上調(diào)iNOS 的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)其心肌保護(hù)作用。由于該研究未進(jìn)行與藥物作用機(jī)制、目的蛋白有關(guān)因子的研究，致使對其作用機(jī)制的推測有一定的局限性。

［1］Fleury C，Sanchis D．The mitochondrial uncoupling protein-2:current status［J］．Int J Biochem Cell Biol，1999，31(11):1261

［2］宋旭東，陳愛華，劉映峰，等．香芹酚預(yù)處理減輕小鼠心肌缺血再灌注時(shí)氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡［J］．南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，33(11):1624

［3］劉仰斌，李啟華，劉欣．苦菜總黃酮對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用［J］．鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2010，45(1):107

［4］Safari F，Hajizadeh S，Shekarforoush S，et al．Influence of ramiprilat and losartan on ischemia reperfusion injury in rat hearts［J］．J Renin Angiotensin Aldosterone Syst，2012，13(1):29

［5］劉艷偉，劉水平，成建定，等．大鼠心肌缺血再灌注模型的改進(jìn)及心電圖判斷指標(biāo)［J］．實(shí)用兒科臨床雜志，2007，22(7):525

［6］葉樹林，王曉蕾，陳利平．丹參多酚酸鹽對兔心肌再灌注損傷的保護(hù)作用［J］．軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，32(6):654

［7］Krauss S，Zhang CY，Scorrano L，et al．Superoxide-mediated activation of uncoupling protein 2 causes pancreatic beta cell dysfunction［J］．J Clin Invest，2003，112(12):1831

［8］胡珂，晏新民，胡志雄，等．關(guān)于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化氧化應(yīng)激方面指標(biāo)的研究進(jìn)展［J］．中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010，7(25):9

［9］Seshiah PN，Weber DS，Rocic P，et al．Angiotensin Ⅱstimulation of NAD(P)H oxidase activity:upstream mediators［J］．Circ Res，2002，91(5):406

［10］Gao J，Zhao WX，Zhou LJ，et al．Protective effects of propofol on lipopolysaccharide-activated endothelial cell barrier dysfunction［J］．Inflamm Res，2006，55(9):385

［11］Sridharan V，Tripathi P，Sharma SK，et al．Cardiac inflammation after local irradiation is influenced by the kallikreinkinin system［J］．Cancer Res，2012，72(19):4984

［12］Duchene J，Ahluwalia A．The kinin B(1)receptor and inflammation:new therapeutic target for cardiovascular disease［J］．Curr Opin Pharmacol，2009，9(2):125