黃芪總苷對二乙基亞硝胺誘導的大鼠肝癌生長的影響

張翔飛

中國人民解放軍防空兵學院門診部 鄭州450052

△男，1961年11月生，本科，副主任醫師，研究方向:內科

在全世界范圍內，肝癌是第6 位最為常見的癌癥類型和第3 位最為常見的癌癥死因，75%～85%的肝癌為肝細胞癌。炎癥和氧化應激在肝細胞癌發生發展過程中起著重要的作用。炎癥可改變促肝細胞癌發生的細胞因子的水平，還可增強氧化應激反應，而氧化應激在引發和加速肝細胞癌變過程中起重要作用［1-2］。黃芪總苷(astragalosides，AT)是補益類中藥黃芪的主要有效成分之一，具有抗氧化［3］、抗炎［4］等作用。楊雁等［5］的研究顯示AT 在體內外對急、慢性肝損傷均有抑制作用，能抑制肝癌細胞株HepG2 和Bel-7404 細胞的增殖。作者采用二乙基亞硝胺(diethyl-nitrosamines，DEN)誘導大鼠肝細胞癌并用AT 處理，觀察大鼠肝癌的生長狀況，并分析血清IL-6、TNF-α 水平及肝組織中氧化應激相關指標的變化，報道如下。

1 材料與方法

1．1 實驗動物、主要試劑及儀器 SD 大鼠，SPF級，雄性，體重180～200 g，由鄭州大學實驗動物中心提供，合格證號:SCXK(豫)2005-0001。AT 購自安徽百草生物科技有限公司，純度≥95%，用羧甲基纖維素鈉混懸。DEN 購自美國Sigma 公司。谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、丙二醛(malonic dialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide diamutase，SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathinone peroxidease，GSH-Px)活性檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。甲胎蛋白(AFP)檢測試劑盒購于上海信然生物技術有限公司。TNF-α 和IL-6 ELISA檢測試劑盒購于北京博奧森生物技術有限公司。電子分析天平購于德國賽多利斯公司。酶標儀購于美國Molecular Devices 公司。

1．2 實驗分組 將50只SD 大鼠按隨機數字表法隨機分為正常組、模型組和低、中、高劑量AT組，每組10只。模型組和AT組灌胃給予大鼠2 g/L DEN溶液，劑量10 mg/kg，1次/d，制備大鼠肝癌模型［6］;正常組給予等量生理鹽水;共灌胃16 周。從造模第1天開始，低、中、高劑量AT組分別按照10、20、40 mg/kg 的劑量灌胃給予AT，正常組和模型組灌胃給予等量羧甲基纖維素鈉。

1．3 觀測指標 于末次給藥24 h 后，用100 g/L 水合氯醛麻醉大鼠，稱體重;斷頭采血，2 000 r/min 離心15 min，分離血清，－20℃保存，微板法測定血清AST 水平，賴氏法測定血清ALT 水平，膠乳增強免疫比濁法測定血清AFP 水平，ELISA 法測定血清IL-6 和TNF-α 水平。取出肝臟稱重，計算肝臟指數，肝臟指數=肝臟質量/體重×100%。記錄肝表面結節數。用游標卡尺測量腫瘤的長徑(a)、短徑(b)，腫瘤體積=1/2 ×a ×b2。取新鮮肝臟組織，加入生理鹽水制成體積分數10%勻漿，－20℃保存;酶聯免疫比色法測定肝組織勻漿中MDA 含量和SOD、GSH-Px 活性。

1．4 統計學處理 采用SPSS 13．0 進行統計學處理，5組間各指標的比較采用單因素方差分析和LSD-t 檢驗，檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 5組大鼠肝臟指數、腫瘤體積及肝表面結節數的比較 見表1。與正常組比較，模型組大鼠肝臟指數明顯增加。與模型組比較，AT組肝臟指數、肝表面結節數、腫瘤體積均減小。

表1 5組大鼠肝臟指數、腫瘤體積及肝表面結節數的比較

2．2 5組大鼠血清AST、ALT 和AFP 水平的比較見表2。與正常組比較，模型組大鼠血清AST、ALT和AFP 水平明顯升高。與模型組比較，AT組大鼠血清AST、ALT 和AFP 水平降低。

表2 5組大鼠血清AST、ALT 和AFP 水平的比較

2．3 5組大鼠血清IL-6 和TNF-α 水平的比較 見表3。與正常組比較，模型組大鼠血清IL-6 和TNFα 水平明顯升高。與模型組比較，AT組血清IL-6 和TNF-α 水平降低。

表3 5組大鼠血清IL-6 和TNF-α 水平的比較

2．4 5組大鼠肝組織中MDA 含量、SOD 和GSHPx 活性的比較 見表4。與正常組比較，模型組大鼠肝組織中MDA 含量明顯升高，SOD 和GSH-Px 活性明顯降低。與模型組比較，AT組肝組織中MDA含量降低，SOD、GSH-Px 活性增強。

表4 5組大鼠肝組織中MDA 含量、SOD 和GSH-Px 活性的比較

3 討論

DEN 是一種具有致癌性的化學毒物，其誘癌動態過程類似于人類肝癌發生過程，歷經肝損傷、肝纖維化、肝硬化最終發展成為肝癌［7］。該研究結果顯示，模型組大鼠肝臟指數較正常組明顯增加，血清AST、ALT 和AFP 水平明顯升高，表明造模成功。與模型組比較，AT組大鼠肝臟指數、腫瘤體積及肝表面結節數，血清AST、ALT 和AFP 水平明顯降低。血清AST、ALT 水平的降低間接表明受損肝細胞數量減少;AFP 水平的降低間接表明肝癌細胞形成數量減少或低分化程度得到一定的阻抑。上述結果表明AT 對DEN 誘發的肝癌具有生長抑制作用。

炎癥與腫瘤細胞形成、進展、增生、浸潤、血管生成、轉移等多個腫瘤發展環節相關。肝癌是與炎癥聯系最為密切的腫瘤之一，往往是在肝炎的基礎上發展起來。IL-6 和TNF-α 是促進肝癌發生發展的兩種重要炎癥介質。Pikarsky 等［8］指出TNF-α 可激活肝細胞內的NF-κB，既能促進細胞變異，導致癌細胞“瘋狂”生長，還能協助變異細胞由原發腫瘤部位轉移到身體其他部位。鄔善敏等［9］通過實驗證實沉默IL-6 基因能夠抑制肝癌細胞遷移，肝癌細胞IL-6 表達增高能促進其自身的遷移。該實驗結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠血清IL-6 和TNF-α水平升高，而AT組大鼠血清IL-6 和TNF-α 水平較模型組顯著降低，提示AT 可能通過抗炎作用阻止肝癌的發生發展。

低水平的活性氧在細胞的生理過程中必不可少，然而，活性氧水平增加可引起氧化應激反應并使細胞處于潛在的毒性環境中，導致生物大分子氧化損傷、中性粒細胞炎性浸潤、組織受損。氧化應激在肝細胞癌的發生與進展中起著關鍵作用。MDA 是脂質過氧化標志物，與肝細胞癌危險因素病毒感染及炎癥具有很好的相關性［1］;SOD 能夠催化超氧陰離子自由基通過歧化反應轉化為氧氣和過氧化氫;GSH-Px 能夠將毒性過氧化物還原成無毒化合物，同時促進過氧化氫分解，避免細胞膜結構與功能遭受過氧化物的損害及干擾。在該研究中，模型組大鼠肝組織中MDA 含量明顯升高，SOD、GSH-Px 活性明顯降低，與何偉等［7］的報道相一致。AT組上述指標較模型組明顯改善，說明AT 能夠明顯抑制DEN 所引起的大鼠體內的氧化應激反應。

總而言之，此次研究初步闡明AT 可抑制DEN誘導的大鼠肝細胞癌的生長，作用機制可能與其抗炎和抗氧化作用有關。

［1］Marra M，Sordelli IM，Lombardi A，et al．Molecular targets and oxidative stress biomarkers in hepatocellular carcinoma:an overview［J］．J Transl Med，2011，9:171

［2］Li Y，Chang SC，Goldstein BY，et al．Green tea consumption，inflammation and the risk of primary hepatocellular carcinoma in a Chinese population［J］．Cancer Epidemiol，2011，35(4):362

［3］王世博，邱景富，白群華，等．黃芪甲苷對H2O2致PC12細胞氧化應激損傷的保護作用［J］．中國藥理學通報，2011，27(11):1603

［4］Gui DK，Huang JH，Guo YP，et al．Astragaloside Ⅳameliorates renal injury in streptozotocin-induced diabetic rats through inhibiting NF-kappa B-mediated inflammatory genes expression［J］．Cytokine，2013，61(3):970

［5］楊雁，陳敏珠．黃芪總苷對肝癌細胞凋亡及wtp53 基因表達的影響［J］．中國藥理學通報，2001，17(4):447

［6］芮文娟，何淑芳，黃先甲，等．DEN 誘導大鼠肝纖維化-肝癌過程中pSmad3L 和PAI-1 蛋白的表達［J］．中國藥理學通報，2012，28(10):1393

［7］何偉，宋莎莎，袁平凡，等．雷公藤紅素對二乙基亞硝胺誘導的大鼠肝纖維化的治療作用及機制［J］．中國藥理學通報，2013，29(4):519

［8］Pikarsky E，Porat RM，Stein I，et al．NF-kappa B functions as a tumour promoter in inflammation-associated cancer［J］．Nature，2004，431(7007):461

［9］鄔善敏，盧超，袁方均．IL-6 對肝癌細胞HepG2 浸潤遷移能力的影響［J］．胃腸病學和肝病學雜志，2012，21(7):594