常染色體顯性遺傳ALPORT綜合征一家系COL4A3及COL4A4的基因突變*

束雙雙，張連云，黃艷梅，張 晶，楊保勝，咸 韋

1)新鄉醫學院法醫物證學教研室 新鄉453003 2)新鄉醫學院第一附屬醫院腎內科 新鄉453003 3)新鄉醫學院第三附屬醫院腎內科新鄉453003

Alport 綜合征(Alport syndrome，AS)又稱遺傳性腎炎，是一種主要累及腎臟的遺傳病。臨床上AS主要表現為患者反復血尿、蛋白尿以及進行性腎功能衰退，可伴有眼部疾病和感音神經性耳聾等腎外表現。目前認為AS 的發病機制與編碼腎小球基底膜上Ⅳ型膠原α3、α4 和α5 鏈的基因突變有關，且具有遺傳異質性。其中，編碼α5 鏈的COL4A5 基因突變可導致性連鎖AS(XLAS，約占85%);編碼α3和α4 鏈的COL4A3 及COL4A4 基因突變可導致常染色體隱性AS(ARAS，約占14%)和常染色體顯性AS(ADAS，約占1%)［1-2］。國內關于ADAS 相關基因突變的報道較少。該研究對一ADAS 家系的COL4A3/COL4A4 基因突變進行了分析。

1 對象與方法

1．1 研究對象 先證者(Ⅲ5)，男，21歲，聽力下降6 a 余，以“顏面浮腫半個月”為主訴入院，半個月前受涼后出現咳嗽、咳痰。檢查示，尿紅細胞90～100/HP，異性紅細胞比例＞60%，為腎小球源性血尿;24 h 尿蛋白定量5 g。血肌酐146 μmol/L，尿素氮8．64 mmol/L。彩超示雙腎彌漫性損傷。電測聽檢查雙耳為中度神經性耳聾。腎活檢病理組織學檢查示腎小球系膜細胞和基質輕至中度彌漫性增生，腎小管上皮細胞灶狀萎縮，腎間質多灶狀淋巴細胞和單核細胞浸潤伴纖維化。電鏡下可見GBM 不規則增厚，節段GBM 變薄，致密層分裂，伴不規則內外側緣，呈“花籃狀”改變，其中可見“電子致密顆粒”。腎活檢組織(圖1)Ⅳ型膠原抗α3、α4 羥基端非膠原區抗體免疫熒光染色為陰性。該患者AS 診斷明確。

圖1 正常人(A)及先證者(B)腎臟基底膜Ⅳ型膠原α 鏈(免疫熒光，×400)

1．2 家系調查 對該家系成員進行詳細調查，調查內容包括年齡、性別、腎功能指標以及聽覺和視覺，繪制系譜圖(圖2)。該家系無近親結婚史，根據系譜分析符合常染色體顯性遺傳。在該家系成員中，Ⅱ7、Ⅲ3、Ⅲ5 有不同程度的鏡下血尿，均為腎小球源性。Ⅱ7、Ⅲ3、Ⅲ5 出現蛋白尿;Ⅱ7、Ⅲ3 有輕度的神經性耳聾，先證者Ⅲ5 出現了腎功能衰竭，Ⅱ7、Ⅲ3 處于腎功能代償期(表1)。Ⅰ1 50歲、Ⅱ3 38歲因腎功能衰竭死亡，Ⅱ1 及Ⅱ4 均有長期血尿史。

圖2 一ADAs 家系系譜圖

表1 一ADAs 家系臨床資料

1．3 全基因組DNA 的提取 知情同意后，采集河南漢族一常染色體顯性遺傳Alport 綜合征家系成員12 人外周靜脈血，其中男7 人(Ⅱ5、Ⅱ7、Ⅲ1、Ⅲ4、Ⅲ5、Ⅲ6、Ⅳ2)，女5 人(Ⅰ2、Ⅱ2、Ⅲ2、Ⅲ3、Ⅳ1)。另取50 名健康人外周靜脈血作為對照。所有血樣本采用有機酚-氯仿法提取基因組DNA。

1．4 PCR擴增及測序參照文獻［3-4］，根 據COL4A3/COL4A4 基因各外顯子臨近區域的內含子序列，合成上、下游引物序列。擴增體系25 μL，其中含10 ×Buffer 2．5 μL，2．0 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L 正反引物各1 μL，DNA Taq 酶1 U，100 mg/L DNA 模版3 μL，ddH2O 16．1 μL。反應條件:95℃預變性2 min;94℃變性45 s，退火45 s，72℃延伸45 s，32個循環;72℃再延伸10 min。擴增后經60 g/L 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增產物，由美國Invitrogen 公司進行雙向測序。分析測序結果并與健康人及GenBank 中序列進行比較。

2 結果

對先證者及該家系中患病者COL4A3/COL4A4基因外顯子進行測序，并與50 名健康人測序結果及GenBank 序列進行對比分析，共篩選出COL4A3/COL4A4 基因8個突變位點，其中包括1個錯義突變、1個內含子突變和6個序列變異。見表2、圖3。

圖3 COL4A3/COL4A4 基因測序結果

COL4A4 基因第44 外顯子的錯義突變c．4195 A ＞T 導致M1399L，該家系有癥狀的患者(Ⅱ7、Ⅲ3、Ⅲ5)均出現了此突變，均表現為雜合子，而作為對照的50 名健康人以及該家系表現正常者中未出現此突變。先證者Ⅲ5 第44 內含子上出現c．4127+11 C ＞T 突變，其他家系成員未見此突變。

3 討論

ADAS 通常是由COL4A3 和(或)COL4A4 基因突變引起，這些基因定位于2q35～q37，分別編碼構成Ⅳ型膠原的α3 及α4 鏈。COL4A3 及COL4A4 基因突變可導致α3 及α4 鏈的異常，引起Ⅳ型膠原分子結構的改變和功能的缺陷，進而影響腎臟基底膜的正常網狀結構［5］。目前25%～50% AS 的突變為甘氨酸取代突變，甘氨酸被認為是最小的氨基酸，可以插入Ⅳ型膠原緊密的三螺旋內部，它的取代突變可破壞螺旋的形成，進而影響基底膜的結構而導致疾病。ADAS 的常見突變包括甘氨酸取代突變、錯義突變、剪接位點突變等，但無明顯的突變熱點［6］。

該研究發現位于COL4A4 基因第44 外顯子上的錯義突變c．4195 A ＞T，導致α4 鏈第1 399個氨基酸由甲硫氨酸替換為亮氨酸(M1399L)，該突變尚未見報道。該家系中凡是有血尿、蛋白尿的患者均出現此突變，表現為雜合子。先證者的母親(Ⅱ2)無臨床表現，基因檢測結果未發現異常，50 名健康人也未檢測到此突變。推測此突變可能為該家系的致病突變位點，這與文獻［7］報道的常見的甘氨酸取代突變有所不同。該突變可能影響了膠原鏈的組裝，但具體機制有待于進一步研究。

該家系中亦發現了一個尚未報道的內含子突變c．4127 +11 C ＞T，該突變僅出現于先證者COL4A4基因上，先證者在該家系存活者中病情最嚴重，已出現腎功能衰竭。由于該突變未出現在剪接位點，先證者病情嚴重程度是否與該突變有關尚不清楚。該研究中作者發現COL4A3/COL4A4 基因上有3個同義突變和3個錯義突變。文獻［8-10］報道以上6個序列變異為多態性位點，這些基因的多態性是否也導致了Ⅳ膠原鏈形成的異常并引起AS 還有待于進一步研究。

研究［11］表明ADAS 具有遺傳多源性。該家系中同樣具有雜合突變的Ⅱ7、Ⅲ3、Ⅲ5，其臨床表現嚴重程度不一，蛋白尿、血尿的程度不一，表型和基因型的關系不明確，推測可能與其他染色體上的基因突變有關，需進一步研究。

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