參與視網膜色素上皮細胞抗氧化應激的重要分子

曾建平，羅玉萍，李思光,2*

(1.南昌大學 生命科學與食品工程學院， 江西 南昌 330031；2.同濟大學 醫學院， 上海 200092)

短篇綜述

參與視網膜色素上皮細胞抗氧化應激的重要分子

曾建平1，羅玉萍1，李思光1,2*

(1.南昌大學 生命科學與食品工程學院， 江西 南昌 330031；2.同濟大學 醫學院， 上海 200092)

慢性氧化應激與許多視網膜病變相關疾病發生相關。氧化應激引起視網膜色素上皮(RPE)胞內蛋白質、脂質、DNA以及細胞器損傷，導致RPE功能紊亂。目前，RPE氧化應激的分子機制及其調控過程尚不清楚。最近研究發現，一些重要的分子伴侶、轉錄因子以及microRNAs參與了RPE抗氧化應激過程的調控，這些發現為視網膜病變相關疾病治療策略的制定提供了新思路。

視網膜色素上皮細胞；氧化應激；年齡相關性黃斑變性

視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)是介于神經視網膜與脈絡膜血管層之間具有高極性的單層上皮，對于視覺功能的正常運轉、支持與維護不可或缺。年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration, AMD)早期發生過程與慢性氧化應激(chronic oxidative stress)引起的RPE衰老及功能紊亂密切相關。引起RPE慢性氧化應激損傷的因素分內因和外因兩個方面：外部因素有衰老、吸煙、高體質量指數(high body mass index, BMI)、高氧壓環境、長時間日光輻射及高脂肪飲食習慣等等；內部因素是由于高能量代謝的需要使細胞局部產生的高濃度活性氧(reactive oxygen species, ROS)。這些ROS超出RPE處理能力時，會引起RPE細胞氧化應激損傷。此外，老化色素(aging pigment)累積也是引起RPE產生氧化應激的重要因素[1- 2]。這些不利因素迫使RPE產生一系列分子應激，包括分子伴侶代謝的改變、抗氧化蛋白的激增、抗氧化酶的激活、參與抗氧化應激調控分子的激活。本文綜述了關于RPE氧化應激相關分子作用機制的最新研究進展。

1 參與RPE氧化應激的分子伴侶

1.1 抗增殖蛋白(prohibitin)

從細菌到人類，抗增殖蛋白在進化上高度保守。該蛋白最初作為抗增殖蛋白為人們所熟知，但確切功能并不清楚。隨后研究發現，抗增殖蛋白也可能作為轉錄調節因子、炎性調節因子、細胞膜受體以及線粒體伴侶(mitochondrial chaperone)發揮作用。

近年來研究表明，抗增殖蛋白是一種穿梭蛋白(shuttling protein)，正常情況下分布于線粒體中，在線粒體中的分布程度與氧化應激水平呈負相關。在氧化應激狀態下，抗增殖蛋白可能作為抗凋亡因子或轉錄調節因子從線粒體轉移到細胞系，發揮抗凋亡作用[3- 5]。研究人員采用siRNA使抗增殖蛋白表達沉默，發現促凋亡因子(包括BAK、caspases)表達上調，而抗凋亡分子(如Bcl-xL)表達下調，這表明抗增殖蛋白可能通過Bcl-xL蛋白參與RPE的抗凋亡過程。此外，免疫共沉淀實驗結果表明，抗增殖蛋白還可能在細胞系內作為轉錄調節因子與P53作用[5]。因此，抗增殖蛋白是一種多功能分子，穿梭于線粒體與細胞系之間，參與線粒體-核信息交流，從而應對應激反應對細胞造成的損傷。

1.2 熱激蛋白

熱激蛋白(heat shock proteins，HSP)是一類高度保守且具有多重功能的蛋白質，涉及細胞周期控制、細胞增值、發育等許多生物學過程，是分子伴侶中的主要成員。作為分子伴侶，HSP參與了蛋白質的合成、折疊、運輸及轉位過程，在過熱、缺血、缺氧和氧化等各種應激條件下，HSP可以防止蛋白質的錯誤折疊與聚集[6]。研究表明，在氧化應激狀態下，RPE中熱激蛋白αB-crystallin、HSP27、HSP70、HSP90α和HSPβ1表達水平發生了顯著改變[7- 8]。這些HSP在RPE氧化應激中大體呈現保護性伴侶特征，如防止受應激損傷蛋白間的非特異聚集。其中小分子熱激蛋白αB-crystallin是脈絡膜小疣(drusen)的重要組成成分之一，而脈絡膜小疣是早期AMD進程的重要標志[8]。目前，HSP作為分子伴侶在RPE抗氧化應激過程中的具體作用及相關信號通路尚不清楚。

2 轉錄因子Nrf2在RPE抗氧化應激中的作用

2.1 轉錄因子Nrf2抗氧化功能及其調控機制

RPE在應對各種氧化應激時會誘發一系列抗氧化分子(包括酶、類胡蘿卜素、維生素、RPE色素顆粒、分子伴侶等)，組成內源性抗氧化防御系統(endogenous antioxidant defense system)，并以此來維持細胞內氧化-還原穩態(redox homeostasis)。這些抗氧化成員的表達是由關鍵轉錄因子-核因子E2相關因子(nuclear factor-E2-related factor 2, Nrf2)所介導的[9]。

Nrf2屬CNC(cap-N-collar)轉錄因子家族，在高氧環境暴露組織器官(如肺臟)中高表達。當細胞處于氧化-還原平衡態時，Nrf2通過泛素與26S 蛋白酶體介導的降解機制維持在基礎水平。這種降解機制由泛素-蛋白酶體系統(ubiquitin-proteasome system, UPS)中泛素連接酶(ubiquitin-protein ligase, E3)復合體CUL3Keap1介導。細胞處于氧化-還原平衡態時，Nrf2與胞質蛋白Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1(Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1, Keap1)結合而錨定在胞質肌動蛋白絲(F-actin)上，沒有活性。當Nrf2胞內水平高于基礎水平時，Keap1會將 CUL3-ROC1復合物招募到Nrf2附近，通過與E3復合物連接的泛素結合酶(ubiquitin-conjugating enzyme, E2)引起Nrf2聚泛素化，接著26S蛋白酶體將其捕獲而誘發降解(圖1)。一旦感應到胞內氧化-還原狀態失衡，復合物CUL3Keap1解聚，該降解過程受到抑制，接著Nrf2進入細胞系與其他轉錄元件結合而啟動Ⅱ相基因(phase II genes)轉錄(圖1)。一般情況下，這些基因編碼的各種抗氧化因子和解毒酶能夠使細胞免受各種自由基的攻擊，并使細胞恢復氧化-還原穩態[9- 10]。

圖1 Nrf2在RPE抗氧化應激中的調控機制Fig 1 Regulatory mechanism of Nrf2 in protection against oxidative stress in RPE cells

2.2 Nrf2與RPE氧化應激及AMD形成的關系

近年來研究發現，Nrf2在RPE應對氧化應激時對相關抗氧化因子及Ⅱ相酶(phase II enzyme)的表達發揮著中心調控作用。Nrf2介導了谷胱甘肽、硫氧還蛋白等各種氧化還原物質與谷胱甘肽硫轉移酶、NADH/NADPH: 醌氧還酶等Ⅱ相酶的表達[11]。此外，哺乳類細胞在應對氧化應激時，由Nrf2介導的蛋白酶體核心顆粒20S與蛋白酶體調節顆粒11S(Pα28αβ)的表達及活性有明顯增加，對于受氧化損傷蛋白的及時清除具有重要作用[12]。研究還發現，20S在保護線蟲和黑腹果蠅細胞應對氧化應激時同樣具有重要意義[13]。

在無任何外源應激因素存在下，Nrf2缺失可引起年齡依賴的視網膜形態與功能變化。研究發現敲除Nrf2的小鼠出現脈絡膜小疣樣沉積，脂褐質積累，炎性蛋白視網膜下層沉著以及脈絡膜新生血管形成。電鏡分析表明，在缺失Nrf2的小鼠RPE細胞內，積累了大量吞噬的視細胞外段、自噬體、自噬溶酶體及聚泛素化聚集體，這與人AMD視網膜中出現的情形相似。有趣的是，這些自噬中間體或并列或毫無規律地堆積在Bruch膜(Bruch membrane，BM)附近，并未進一步降解。這是由于Nrf2的缺失，導致受其調控的抗氧化與解毒蛋白的表達缺失，進而導致大量氧化損傷的大分子及細胞器增加并進入自噬降解途徑，這影響了溶酶體降解系統效率，最終超出了RPE細胞的自噬降解能力[14]。這進一步說明Nrf2在細胞應對氧化應激中的重要作用。

3 miRNAs在RPE抗氧化應激中的研究

miRNA是一類長度為22 nt左右的內源性非編碼單鏈小RNA，在轉錄后水平上負調節基因表達。miRNA除參與體內正常的生理過程外，還參與了許多病理進程，如病理性血管生成、氧化應激及炎性反應等[15]。

3.1miR-23a和miR-30在RPE抗氧化應激中的作用

有研究發現，miR-23a可使RPE免遭氧化應激誘導的細胞損傷。miR-23a是miR-23～27～24簇的成員，在AMD患者的RPE細胞中表達下調。miR-23a在濃度低于200 μmol/L H2O2處理的RPE細胞內表達上調，而H2O2濃度高于300 μmo/L時表達下調；過表達miR-23a能降低H2O2誘導的RPE凋亡。Fas配體(Fas ligand)是一種凋亡誘導配體，與ROS介導的凋亡有關。Fas是miR-23a直接作用的靶基因。H2O2能誘導Fas表達上調，而miR-23a可以減弱這一過程[16]。此外，在miR-23～27～24家族成員中，miR-27a*與miR-27b*在H2O2處理的巨噬細胞RAW264.7中均表達下調，其功能可能是通過改變NFκ B通路來調節巨噬細胞功能[17]，而miR-27與miR-27*在RPE細胞中的功能尚不清楚。

最近, 研究人員發現在所有可能靶向過氧化氫酶(catalase, Cat)的miRNA中，miR-30b不僅靶向Cat，而且還涉及許多與視網膜疾病關聯的重要基因，如整合素β3(integrin beta 3, ITGB3)、對氧磷酶2(paraoxonase 2, PON2)等。進一步研究表明，成人RPE細胞系ARPE-19經200 μmol/L H2O2處理18 h，miR-30b與miR-30d均表達上調，其中miR-30b上調顯著。將miR-30b模擬物(miR-30b mimics)及其反義物(antagomirs)分別轉染氧化損傷的ARPE-19細胞，結果發現miR-30能夠調控過氧化氫酶的表達，表明miR-30b參與了RPE抗氧化應激進程[18]。

3.2 其他參與抗氧化應激調控的miRNA

除上述miR-23a及miR-30b在RPE氧化應激中有確切功能闡釋外，研究還發現若干miRNA在其他類型細胞的氧化應激應答中發揮作用。如在心肌細胞中過表達miR-210能夠抑制由缺氧復氧(hypoxia-reoxygenation)誘發的ROS生成及細胞凋亡[19]。在血管生成祖細胞(angiogenic progenitor cells)中過表達miR-21發現會沉默SOD-2的表達，并由此促進ROS生成[20]。miR-24在鼠的心肌細胞中通過抑制促凋亡因子(如Bim、caspase-9、Apaf-1)來抑制細胞凋亡[21]。此外，miR-200c和miR-204均在H2O2誘導下表達上調，它們與氧化應激誘導的細胞凋亡有關[22- 23]。

4 問題與展望

盡管AMD形成的分子機制還不清楚，但普遍認為由其引起的RPE細胞病變是AMD病因學的重要方面[24- 25]。近十來年人們采用蛋白組學方法對氧化應激下RPE細胞、脈絡膜小疣及脂褐質相關蛋白表達差異進行研究，發現不同來源的RPE細胞受氧化應激影響引起的蛋白表達譜變化不同，其原因尚不清楚[8,26]。因此，發掘AMD病理相關分子標志以及探究AMD病理發生過程中的關鍵調控分子已成為該領域的研究重點。

此外，針對已發現的AMD病理進程中關鍵調控分子來開發有確切療效的藥物也是未來的重要研究方向。例如，在人肺巨噬細胞中的研究中發現，Nrf2的可誘導性與細胞保護能力隨著年齡的增加而降低。高齡吸煙者與高齡不吸煙者相比，Nrf2 表達水平下降顯著[27]。這對于我們理解AMD發生的分子機制具有啟發意義。同時，由此提供了一個潛在的AMD治療策略，即通過藥理學的方法或者通過拮抗Nrf2的負相關調節因子以增加或維持RPE細胞內Nrf2的活性水平來達到AMD的治愈目的。朝著這個目標，大量Nrf2激活因子亟需在不同模型系統中進行藥理學鑒定和試驗[28]。納米技術與微膠囊技術在視網膜疾病中的應用將來可能是實現上述策略的有效途徑[29- 30]。

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Molecules involved in protectionof retinal pigment epithelial cells against oxidative stress

ZENG Jian-ping1, LUO Yu-ping1, LI Si-guang1,2*

(1.School of Life Science and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330031；2.School of Medicine, Tongji University, Shanghai 200092, China)

Chronic oxidative stress is involved in the development of many retinal degenerative-related diseases. Oxidative stress may induce the damages of proteins, lipids, DNA and organelles in retinal pigment epithelial (RPE), and cause RPE cellular dysfunction. So far, the molecular mechanism and regulatory process of oxidative stress in RPE still remain unclear. Recent studies found that some of molecular chaperones, transcription factors and microRNAs play a critical role in protection against oxidative stress in RPE, which may provide new therapeutic strategies for retinal degenerative-related diseases.

retinal pigment epithelial cell; oxidative stress; age-related macular degeneration

2013- 08- 09

2013- 11- 21

國家自然科學基金(31171317, 31271375, 31271450)；江西省自然科學基金(2010GZN0141)；江西省衛生廳科技計劃(20092042, 20092043)

*通信作者(correspondingauthor)： siguangli@163.com

1001-6325(2014)06-0861-05

Q 291

A