分支DNA技術檢測血漿游離DNA方法的建立及在急性心肌梗死患者中的初步應用

趙 麗，景蓉蓉，張魯榕，俞榮華

循環游離 DNA(circulating free DNA，cf-DNA)是一種無細胞狀態的胞外DNA，廣泛存在于血液(血清或血漿)、滑膜液和腦脊液等體液中。近來的研究表明在創傷、腫瘤、自身免疫性疾病和炎性反應等病理過程中可檢測到cf-DNA的改變［1］。血液不同于其他體液，來源于全身各處，因而對血 cf-DNA含量進行準確定量具有重要意義。

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)患者具有發病急、并發癥多、病死率高等特點［2－3］。隨著生物醫學的進步，心臟的生物學標志物如肌鈣蛋白 I(cTnI)、肌酸激酶同功酶 MB(CK-MB)和肌紅蛋白(MYO)等已廣泛應用于AMI的診斷。然而，現有的心臟生物學標志物也存在一定的缺點，如cTnI窗口期長而診斷再梗死以及判斷梗死范圍的能力差等。因此，人們仍在不斷的探索特異性、敏感性及診斷價值更高的心臟生物學標志物。目前國內未見AMI患者血cf-DNA含量的相關報道。本研究擬采用分支 DNA(branched DNA，bDNA)信號放大的定量檢測技術建立檢測血中cf-DNA-ALU含量的方法，并對其進行方法學評價，初步應用于AMI患者的檢測。

1 材料與方法

1.1 標本來源

實驗組:2010年5月至2011年8月在南通大學附屬醫院就診的82例AMI患者(年齡40～85歲，男性50例，女性32例)。符合美國心臟病學會/美國心臟協會2007診斷標準確診為AMI。排除標準:1)既往有AMI史;2)合并慢性心功能不全、外傷、腫瘤、肺栓塞、中風、心肌病、肝臟疾病、腎臟疾病及免疫系統疾病;3)正在上述疾病治療中。對照組:60名在南通大學附屬醫院體檢中心的健康成人。本研究中，所有受試對象均匿名。本研究經南通市第四人民醫院醫學倫理委員會批準。對照組血液標本于清晨采血。AMI組于胸痛發作6 h內采血。均采集肘靜脈血2 mL。將采集的肘靜脈血2 mL，立即置于肝素抗凝管中，4 000 r/min離心5 min，取血漿置于離心管，－80℃凍存。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

針對ALU基因的捕獲輔助探針(capture extender，CE)、標記輔助探針(labeled extender，LE)和封閉探針(Blocking probe，BL)由美國羅切斯特大學放射腫瘤系張魯榕教授提供。裂解液、含捕獲探針的96孔板、前放大探針和放大探針、堿性磷酸酶標記探針(Panomics公司)。人類基因組DNA標準品(Promega公司)。cTnI、CK-MB和MYO檢測試劑盒(上海藍怡公司)。

1.3 bDNA技術檢測血ALU基因含量的基本原理

將捕獲探針固化在96孔板上，CE一端與靶序列結合，另一端與捕獲探針結合;LE一端與靶序列結合，樣本其余位點用BL封閉;LE的另一端接前放大探針，再接放大探針，每個放大探針上可接堿性磷酸酶標記探針。通過與底物反應，使得檢測敏感性更高。

1.4 bDNA技術檢測血ALU基因含量的步驟

血漿標本用雙蒸水1∶20稀釋后，置95℃加熱5 min，冰水即刻冷卻。取90μL探針工作液(裂解液、TE緩沖液、蛋白酶 K、BL、CE和 LE組成)和10μL DNA樣本(樣本、質控品雙份測定，標準品3份測定)加入包被了捕獲探針的96孔反應板。錫泊紙封閉微孔板，立即放入雜交爐55℃雜交1 h。每孔加入300μL洗滌液洗板3次后各孔加1∶1 000稀釋的前放大探針100μL，55℃孵育30 min;同樣洗板后，每孔加1∶1 000稀釋的放大探針100μL，55℃孵育30 min和1∶1 000稀釋的標記探針50℃孵育30 min。再次洗板后每孔加100μL底物工作液，室溫下孵育5～10 min后，在發光儀讀每孔吸光度(A)值，求每樣本的平均值，以標準品濃度和A值繪制標準曲線，根據標準曲線計算每樣本稀釋后的ALU含量，將結果乘以20即得每樣本的ALU的含量。

1.5 bDNA技術檢測血ALU基因含量的方法學評價

將購買的人類基因組DNA標準品進行2倍系列稀釋(濃度依次為 400、200、100、50、25、12.5、6.25和0 ng/mL)，以不同濃度的人類基因組DNA標準品為橫坐標，以相應濃度標準品的吸光度為縱坐標，建立了檢測ALU的標準曲線。

以濃度分別為20、100和200 ng/mL的DNA標準液，同一批重復做12個測定，計算批內CV值;連續測定12 d，以每個濃度12個測定結果計算批間CV值。

在ALU含量為50 ng/mL的樣品中取0.9 mL溶液分別加入濃度為50、100、200和400 ng/mL的標準溶液0.1 mL進行回收實驗。

1.6 統計學分析

用Sigmaplot 11.0軟件進行統計分析。ALU含量用中位數(四分位區間)［M(P25～P75)］表示。AMI組和正常對照組 ALU含量比較用 Student's paired-sample t檢驗。批內、批間不精密度用變異系數(CV)表示。0.99，斜率=1779(圖1)。以空白檢測結果的均值加上3倍標準差為本方法的最低檢測限，濃度為0.86 ng/mL。該方法的批內 CV為 7.85% ～11.75%，批間CV為10.05% ～14.32%(表1)。加入濃度50、100、200和400 ng/mL的標準溶液后回收率為106.01%、96.33%、104.03%和93.35%。

2.2 ALU在健康對照組和AMI組中的含量

用建立的 bDNA技術檢測。82例 AMI患者ALU的含量(中位數4 223 ng/mL，四分位數區間2 285～7 864 ng/mL)遠高于60例健康對照組者(中位數118 ng/mL，四分位數區間81～218 ng/mL)(P ＜0.0001)。

2.3 AMI患者ALU含量和心肌標志物的相關性分析

82例 AMI患者血漿 cTnI、CK-MB和 MYO與ALU表達量無相關性(圖2)。

2.4 血漿ALU含量對AMI診斷效能的評價

本研究對AMI患者ALU含量結合健康對照組作ROC曲線，其曲線下的面積分別為0.99，敏感度98.8%，特異性100.0%，診斷界值631 ng/mL(圖3)。

圖1 bDNA技術檢測ALU方法的線性Fig 1 The linearity of bDNA-based ALU assay

2 結果

2.1 bDNA技術檢測血中ALU基因含量的方法學評價

標準品濃度在0～400 ng/mL內成線性，R2=

圖2 血漿ALU含量與cTnI、CK-MB、MYO相關性分析Fig 2 Correlation of ALU with troponin I，CK-MB and MYO

表1 批內和批間變異Table 1 Intra-assay variation and Inter-assay variation(x ± s，n=12)

圖3 ALU診斷急性心肌梗死的ROC曲線Fig 3 ROC curve for ALU in order to diagnose AMI

3 討論

目前，國內外應用較多的是實時熒光定量PCR方法檢測cf-DNA含量，但由于外周血中cf-DNA含量極其微弱，提取的DNA濃度和純度總是達不到理想的效果而且費時、價格相對較高［4－5］。本研究選取ALU基因建立一種類似“酶聯免疫吸附法”的檢測手段-bDNA技術檢測血cf-DNA的含量。ALU家族是靈長類基因組特有的含量豐富的中度重復序列，人類基因組全部基因的3/4都和ALU有關。bDNA技術不同于PCR技術，是一種雜交基礎上的信號放大系統。選擇ALU基因并結合bDNA技術可提高cf-DNA檢測的敏感度［6］。本檢測方法一個測試僅需要10μL血漿，極大簡化操作步驟。

血cf-DNA的含量與AMI的關系如何?本研究中AMI組ALU含量遠高于健康對照組，這與通過染料法定量 AMI患者血 cf-DNA的結果一致［7］。ROC分析顯示血ALU的診斷敏感度和特異度顯著高于血cTnI、CK-MB和MYO。這表明血中ALU的定量檢測對AMI的輔助診斷有一定的價值。血cTnI、CK-MB和MYO是臨床常用的心肌診斷標志物，但通過相關性分析未發現與血cf-DNA相關性，可能的原因是這些指標的生物半衰期不同，在發病的6 h內尚未達到最高峰。

總之，本研究應用bDNA技術定量檢測血ALU的含量，具有靈敏、重復性好、線性范圍寬等優點，并用該方法首次證實了AMI患者中ALU含量增加，但ALU能否作為AMI早期診斷指標以及與疾病進程的關系仍需擴大樣本量并進行動態的觀察研究。

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