不同配比微生物毒性傳感器對河豚毒素毒性的測定及與HPLC法比較

陳婧+楊卓

摘要：河豚毒素傳感器響應性能與固定化菌體的量和輔料的量都有一定關系。設計微生物量為10 μL，不加輔料及加入1%、2%輔料3種微生物膜，以夾層法固定微生物膜，以氧電極為換能器，分別組裝微生物傳感器，通過測定傳感器的線性范圍、線性相關系數以及加標回收率等獲知固定化膜的通透性的好壞和響應信號的大小，最后確定3種組合中較優膜為10 μL菌懸液加入1%的輔料。以最優膜組裝毒性傳感器與高效液相色譜方法的對照發現兩者的差異不顯著，表明試驗建立的毒性微生物傳感器方法可以很好地測定河豚毒素的毒性。

關鍵詞：河豚毒素;毒性傳感器;HPLC法;微生物膜

中圖分類號：S852.4+4 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）20-4952-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.048

Biosensor Monitoring Tetrodotoxin with Toxicity Sensor of Different Ratio Microbes

and Comparison with HPLC Methods

CHEN Jing， YANG Zhuo

（Environmental Management College of China， Qinhuangdao 066004， Hebei，China）

Abstract： Tetrodotoxin sensor response performance is closely related with the amount of immobilized bacteria and accessories. Three kinds of microbial membrane were designed. The first one was 10 μL microbial without no accessory material. The second one was 10 μL microbial with 1% accessory material. The third one was 10 μL microbial with 2% accessory material immobilized by sandwich immobilization. A biosensor was fabricated based on oxygen electrode. By measuring the linear range， the linear correlation and the reclaim rate of the two sensor， the property of membrane and value of the response signal was found out. Results showed that 10 microbial with 1% auxiliary materials was the optimal combination of the two membrane. The toxicity sensor was assembled with the optimal membrane and compared with HPLC method. The results showed that the difference between the two methods was not significant. The toxicity microbial sensor method could accurately measure TTX.

Key words： tetrodotoxin; toxicity sensor; HPLC; biofilm

河豚毒素（Tetrodotoxin，簡稱TTX）是一種強神經毒素，目前河豚毒素檢測的標準方法是小鼠生物測定法[1]，其他的檢測方法如高效液相色譜法[2]、免疫學方法[3]也日漸成熟。微生物傳感器方法[4]由于其方法快捷迅速、價格低廉，越來越成為河豚毒素檢測方法研究的重點。有文獻報道[5-8]，以地衣芽孢桿菌作為響應菌株，采用夾層法制備微生物傳感器測試其對河豚毒素的響應情況，在濃度10～100 μg/L范圍內線性較好。

傳感器響應性能與固定化菌體的量和輔料的量都有一定關系。在提高微生物膜的重現性及測量范圍的可行性問題上設計微生物量為10 μL和輔料量分別占濕菌體0%、1%、2% 3種組合的微生物膜的性能測試。通過測定傳感器的線性范圍、線性相關系數以及加標回收率等獲知固定化膜的通透性的好壞和響應信號的大小，確定菌體和輔料的最佳配比。為了驗證地衣芽孢桿菌毒性傳感器性能，將毒性傳感器方法與河豚毒素的高效液相色譜檢測方法對比，測試毒性傳感器測量的準確性。

1 ?材料與方法

1.1 ?主要試劑

GGA標準溶液：取質量濃度均為150 mg/L的葡萄糖溶液和谷氨酸溶液，等體積混合，溶液中BOD5的質量濃度為（198±30.5） mg/L。

試驗底液（磷酸鹽緩沖溶液）：分別稱取KH2PO4、Na2HPO4·12H2O 0.4539、5.970 g，用1 200 mL蒸餾水稀釋溶解，pH 7.6。

TTX貯備液：稱量TTX 1.0 mg溶于10.0 mL 的去離子水中，此時溶液濃度為100 mg/L，濃度較高，較易保存，將此作為TTX貯備溶液，4 ℃保存待用。

TTX標準溶液的配制：由TTX標準貯備液分別稀釋配制成10、20、45、50、75、100 μg/mL系列標準溶液，現用現配。

培養基：牛肉膏 0.5 g、蛋白胨 0.5 g、可溶性淀粉 0.5 g、氯化鎂 0.1 g、蒸餾水100 mL，pH 7.0。

醋酸纖維素膜（北京化工學校附屬工廠）;特快超能膠（漢高粘合劑有限公司）;河豚毒素標準品（分析純，河北省水產研究所）;甲醇 （色譜純，天津市康科德科技有限公司）;醋酸（色譜純，天津市康科德科技有限公司）;試驗所用水為石英二次去離子水。

1.2 ?試驗方法

1.2.1 ?固定化微生物膜的制作 ?用微量取液器分別吸取一定配比菌懸液滴在生物膜上，采用夾層法將兩層膜邊粘合起來，保存以備用。

1.2.2 ?試驗流程 ?按圖1組裝河豚毒素毒性傳感器。在35 ℃，pH 7.6，以 GGA質量濃度為21.5 mg/L的試驗底液穩定一段時間，記錄穩定后的電流值I0。然后將一定體積的毒素溶液加入底液中，等待新的平衡，記錄再次穩定后的電流值It，通過試驗可知電流的變化ΔI（ΔI=It–I0）與TTX的量成一定比例關系，得到TTX濃度～ΔI的線性關系曲線圖。

1.2.3 ?最優膜的設計 ?制備3種組合的微生物膜，組合比例分別為①10 μL濕菌體+0輔料、②10 μL濕菌體+1%輔料③10 μL濕菌體+2%輔料，分別組裝河豚毒素的毒性傳感器。試驗條件均為為：35 ℃、pH 7.6，底液中GGA質量濃度為21.5 mg/L[5]，進行如下3個試驗：

Ⅰ精密度測試：平行6次測定傳感器對質量濃度為50 μg/L TTX溶液的響應信號，計算測量的平均值、標準偏差及變異系數。

Ⅱ標準曲線的繪制：測定3種類型毒性微生物傳感器對不同濃度TTX溶液的響應情況，得到的標準曲線，線性響應范圍、線性方程及線性相關系數。

Ⅲ加標回收率試驗：取TTX樣品做加標回收率試驗。

1.2.4 ?高效液相色譜測試條件的選擇

1）流速的選擇。選擇流動相為醋酸和去離子水，設定總流速為8.000 mL/min，試驗醋酸流速為0.799、0.798、0.796、0.792、0.790、0.788、0.785、0.783、0.780 mL/min時基線穩定情況和TTX分離情況。

2）保留時間。流動相為醋酸和去離子水，在上述確定的流速下向液相色譜儀中注射濃度為50、75、100 μg/mL的TTX標準溶液，觀察液相色譜圖，確定其保留時間。

3）檢測波長的選擇。流動相為醋酸和去離子水，在上述確定的流速、保留時間下測定波長分別為220、225、230、235、240 nm 的出峰情況，找到在上述色譜條件下TTX的最大吸收波長。

2 ?結果與分析

2.1 ?傳感器方法最優膜的確定

3個試驗測試結果見表1，3種毒性傳感器的響應曲線見圖2。如表1及圖2所示，3種固定化方法的線性范圍都在10～80 μg/L之間，線性相關系數都在0.96以上;精密度和準確度都滿足毒性測量的要求，都可用于微生物傳感器對河豚毒素的毒性測試，但是加入1%輔料的微生物膜精密度高于其他配比的膜，線性相關系數也比其他配比膜好，制備的微生物膜性能優于其他配比的微生物膜，是這3種配比微生物膜中的較優膜。10 μL菌懸液加入1%的輔料是制備地衣芽孢桿菌毒性微生物膜過程中菌液與輔料的最佳配比。

2.2 ?HPLC條件的確定

試驗確定高效液相色譜條件為：ODS柱（150 mm×6 mm，5 μm），流動相為醋酸和去離子水，醋酸流速為0.798 mL/min，去離子水流速為0.002 mL/min，檢測波長230 nm;TTX保留時間為8.5 min;室溫。

2.3 ?HPLC標準曲線

配制濃度分別為10、20、45、50、75 100 μg/mL TTX系列標準溶液，按照“2.2”的色譜條件，各進樣10 μL，記錄在此色譜條件下各系列標準毒素的峰面積，以峰面積為縱坐標，河豚毒素濃度為橫坐標，繪制高效液相色譜法測定河豚毒素標準曲線見圖3。如圖3所示，TTX在濃度20～100 μg/mL范圍內線性關系良好，線性回歸方程為y=680.93x-4 544.20，相關系數為0.995 6。

2.4 ?兩種測試方法結果比較

在“2.2”確定的色譜條件下向液相色譜儀中注射10 μL未知濃度的TTX樣品，測定未知樣品的峰面積，利用圖3的標準曲線y=680.93x-4 544.20計算出樣品濃度;以最優膜組裝毒性傳感器，試驗測得未知樣品稀釋1 000倍后電流差值△I，標準曲線的回歸方程為y=0.002 5x+0.012 2，由此可以計算出稀釋后的樣品濃度，兩種測定方法對同一未知樣品的測定結果見表2。兩種測定方法的結果用SPSS軟件進行顯著性t檢驗，可知P>0.05，兩者的差異不顯著，兩種測定方法對樣品的測定結果有很好的一致性。

3 ?小結與討論

試驗測試了10 μL菌懸液加入0%、1%、2%3種微生物組裝的傳感器對河豚毒素的響應，結果表明，這3種微生物傳感器都可滿足微生物傳感器測試毒性的要求，10 μL地衣芽孢桿菌菌懸液加入1%輔料制膜組裝的傳感器性能最優。在實驗室自有的條件下，利用高效液相色譜法測定TTX的毒性，通過試驗得到最佳的色譜條件為：分析柱為ODS柱（150 mm×6 mm，5 μm），流動相：醋酸和去離子水，流速分別為0.798 mL/min和0.002 mL/min，檢測波長：230 nm;TTX保留時間為8.5 min;室溫;在此色譜條件下，測得TTX濃度在20～100 μg/mL范圍內線性關系良好，線性回歸方程為y=680.93x-4 544.20，相關系數為0.995 6。同時利用課題裝的地衣芽孢桿菌毒性微生物傳感器和高效液相色譜法測定未知濃度的TTX的毒性。通過結果對比，高效液相色譜法與微生物傳感器的測定結果有很好的一致性，試驗建立的微生物傳感器方法可以很好的測定河豚毒素濃度，但是仍有許多不足之處有待進一步研究，比如傳感器的穩定性和響應范圍，微生物膜固定化技術的優化等，可以作為下一階段研究的重點。

參考文獻：

[1] 段發淼，謝心磊，朱寶平.用小鼠單位法檢測河豚毒素[J].中國衛生檢驗雜志，2000，8（4）：463-464.

[2] 舒 ?靜，李柏林，歐 ?杰.離子色譜法定量檢測酒曲發酵液中的河豚毒素[J].色譜，2011（2）：187-190.

[3] 叢 ?蕾，王錫昌，劉 ?源，等.河豚毒素免疫抗原的制備及其表征體系的建立[J].中國預防獸醫學報，2010（6）：41-494.

[4] 黃 ?正，任 ?恕.微生物傳感器在污染物生物毒性分析中的應用[J].傳感器技術，2004，23（9）：4-6.

[5] 崔建升，陳 ?婧，王 ?芳，等.微生物傳感器測定河豚毒素研究[J].海洋環境科學，2009（6）：726-728.

[6] 陳唯真，朱維華，俞如英.HPLC法測定河豚毒素的含量及穩定性[J].藥物分析雜志，2004，24（1）：41-43.

[7] 劉海新，張 ?農，董黎明，等.柱后衍生高效液相色譜法測定水產品種河豚毒素的含量[J].水產學報，2006，30（6）：812-817.

[8] 張 ?虹，柳正良，黃蓓琳，等.反向離子對-高效液相色譜法測定河豚毒素[J].中國現代應用藥學雜志，2001，18（3）：197-198.

TTX標準溶液的配制：由TTX標準貯備液分別稀釋配制成10、20、45、50、75、100 μg/mL系列標準溶液，現用現配。

培養基：牛肉膏 0.5 g、蛋白胨 0.5 g、可溶性淀粉 0.5 g、氯化鎂 0.1 g、蒸餾水100 mL，pH 7.0。

醋酸纖維素膜（北京化工學校附屬工廠）;特快超能膠（漢高粘合劑有限公司）;河豚毒素標準品（分析純，河北省水產研究所）;甲醇 （色譜純，天津市康科德科技有限公司）;醋酸（色譜純，天津市康科德科技有限公司）;試驗所用水為石英二次去離子水。

1.2 ?試驗方法

1.2.1 ?固定化微生物膜的制作 ?用微量取液器分別吸取一定配比菌懸液滴在生物膜上，采用夾層法將兩層膜邊粘合起來，保存以備用。

1.2.2 ?試驗流程 ?按圖1組裝河豚毒素毒性傳感器。在35 ℃，pH 7.6，以 GGA質量濃度為21.5 mg/L的試驗底液穩定一段時間，記錄穩定后的電流值I0。然后將一定體積的毒素溶液加入底液中，等待新的平衡，記錄再次穩定后的電流值It，通過試驗可知電流的變化ΔI（ΔI=It–I0）與TTX的量成一定比例關系，得到TTX濃度～ΔI的線性關系曲線圖。

1.2.3 ?最優膜的設計 ?制備3種組合的微生物膜，組合比例分別為①10 μL濕菌體+0輔料、②10 μL濕菌體+1%輔料③10 μL濕菌體+2%輔料，分別組裝河豚毒素的毒性傳感器。試驗條件均為為：35 ℃、pH 7.6，底液中GGA質量濃度為21.5 mg/L[5]，進行如下3個試驗：

Ⅰ精密度測試：平行6次測定傳感器對質量濃度為50 μg/L TTX溶液的響應信號，計算測量的平均值、標準偏差及變異系數。

Ⅱ標準曲線的繪制：測定3種類型毒性微生物傳感器對不同濃度TTX溶液的響應情況，得到的標準曲線，線性響應范圍、線性方程及線性相關系數。

Ⅲ加標回收率試驗：取TTX樣品做加標回收率試驗。

1.2.4 ?高效液相色譜測試條件的選擇

1）流速的選擇。選擇流動相為醋酸和去離子水，設定總流速為8.000 mL/min，試驗醋酸流速為0.799、0.798、0.796、0.792、0.790、0.788、0.785、0.783、0.780 mL/min時基線穩定情況和TTX分離情況。

2）保留時間。流動相為醋酸和去離子水，在上述確定的流速下向液相色譜儀中注射濃度為50、75、100 μg/mL的TTX標準溶液，觀察液相色譜圖，確定其保留時間。

3）檢測波長的選擇。流動相為醋酸和去離子水，在上述確定的流速、保留時間下測定波長分別為220、225、230、235、240 nm 的出峰情況，找到在上述色譜條件下TTX的最大吸收波長。

2 ?結果與分析

2.1 ?傳感器方法最優膜的確定

3個試驗測試結果見表1，3種毒性傳感器的響應曲線見圖2。如表1及圖2所示，3種固定化方法的線性范圍都在10～80 μg/L之間，線性相關系數都在0.96以上;精密度和準確度都滿足毒性測量的要求，都可用于微生物傳感器對河豚毒素的毒性測試，但是加入1%輔料的微生物膜精密度高于其他配比的膜，線性相關系數也比其他配比膜好，制備的微生物膜性能優于其他配比的微生物膜，是這3種配比微生物膜中的較優膜。10 μL菌懸液加入1%的輔料是制備地衣芽孢桿菌毒性微生物膜過程中菌液與輔料的最佳配比。

2.2 ?HPLC條件的確定

試驗確定高效液相色譜條件為：ODS柱（150 mm×6 mm，5 μm），流動相為醋酸和去離子水，醋酸流速為0.798 mL/min，去離子水流速為0.002 mL/min，檢測波長230 nm;TTX保留時間為8.5 min;室溫。

2.3 ?HPLC標準曲線

配制濃度分別為10、20、45、50、75 100 μg/mL TTX系列標準溶液，按照“2.2”的色譜條件，各進樣10 μL，記錄在此色譜條件下各系列標準毒素的峰面積，以峰面積為縱坐標，河豚毒素濃度為橫坐標，繪制高效液相色譜法測定河豚毒素標準曲線見圖3。如圖3所示，TTX在濃度20～100 μg/mL范圍內線性關系良好，線性回歸方程為y=680.93x-4 544.20，相關系數為0.995 6。

2.4 ?兩種測試方法結果比較

在“2.2”確定的色譜條件下向液相色譜儀中注射10 μL未知濃度的TTX樣品，測定未知樣品的峰面積，利用圖3的標準曲線y=680.93x-4 544.20計算出樣品濃度;以最優膜組裝毒性傳感器，試驗測得未知樣品稀釋1 000倍后電流差值△I，標準曲線的回歸方程為y=0.002 5x+0.012 2，由此可以計算出稀釋后的樣品濃度，兩種測定方法對同一未知樣品的測定結果見表2。兩種測定方法的結果用SPSS軟件進行顯著性t檢驗，可知P>0.05，兩者的差異不顯著，兩種測定方法對樣品的測定結果有很好的一致性。

3 ?小結與討論

試驗測試了10 μL菌懸液加入0%、1%、2%3種微生物組裝的傳感器對河豚毒素的響應，結果表明，這3種微生物傳感器都可滿足微生物傳感器測試毒性的要求，10 μL地衣芽孢桿菌菌懸液加入1%輔料制膜組裝的傳感器性能最優。在實驗室自有的條件下，利用高效液相色譜法測定TTX的毒性，通過試驗得到最佳的色譜條件為：分析柱為ODS柱（150 mm×6 mm，5 μm），流動相：醋酸和去離子水，流速分別為0.798 mL/min和0.002 mL/min，檢測波長：230 nm;TTX保留時間為8.5 min;室溫;在此色譜條件下，測得TTX濃度在20～100 μg/mL范圍內線性關系良好，線性回歸方程為y=680.93x-4 544.20，相關系數為0.995 6。同時利用課題裝的地衣芽孢桿菌毒性微生物傳感器和高效液相色譜法測定未知濃度的TTX的毒性。通過結果對比，高效液相色譜法與微生物傳感器的測定結果有很好的一致性，試驗建立的微生物傳感器方法可以很好的測定河豚毒素濃度，但是仍有許多不足之處有待進一步研究，比如傳感器的穩定性和響應范圍，微生物膜固定化技術的優化等，可以作為下一階段研究的重點。

參考文獻：

[1] 段發淼，謝心磊，朱寶平.用小鼠單位法檢測河豚毒素[J].中國衛生檢驗雜志，2000，8（4）：463-464.

[2] 舒 ?靜，李柏林，歐 ?杰.離子色譜法定量檢測酒曲發酵液中的河豚毒素[J].色譜，2011（2）：187-190.

[3] 叢 ?蕾，王錫昌，劉 ?源，等.河豚毒素免疫抗原的制備及其表征體系的建立[J].中國預防獸醫學報，2010（6）：41-494.

[4] 黃 ?正，任 ?恕.微生物傳感器在污染物生物毒性分析中的應用[J].傳感器技術，2004，23（9）：4-6.

[5] 崔建升，陳 ?婧，王 ?芳，等.微生物傳感器測定河豚毒素研究[J].海洋環境科學，2009（6）：726-728.

[6] 陳唯真，朱維華，俞如英.HPLC法測定河豚毒素的含量及穩定性[J].藥物分析雜志，2004，24（1）：41-43.

[7] 劉海新，張 ?農，董黎明，等.柱后衍生高效液相色譜法測定水產品種河豚毒素的含量[J].水產學報，2006，30（6）：812-817.

[8] 張 ?虹，柳正良，黃蓓琳，等.反向離子對-高效液相色譜法測定河豚毒素[J].中國現代應用藥學雜志，2001，18（3）：197-198.

TTX標準溶液的配制：由TTX標準貯備液分別稀釋配制成10、20、45、50、75、100 μg/mL系列標準溶液，現用現配。

培養基：牛肉膏 0.5 g、蛋白胨 0.5 g、可溶性淀粉 0.5 g、氯化鎂 0.1 g、蒸餾水100 mL，pH 7.0。

醋酸纖維素膜（北京化工學校附屬工廠）;特快超能膠（漢高粘合劑有限公司）;河豚毒素標準品（分析純，河北省水產研究所）;甲醇 （色譜純，天津市康科德科技有限公司）;醋酸（色譜純，天津市康科德科技有限公司）;試驗所用水為石英二次去離子水。

1.2 ?試驗方法

1.2.1 ?固定化微生物膜的制作 ?用微量取液器分別吸取一定配比菌懸液滴在生物膜上，采用夾層法將兩層膜邊粘合起來，保存以備用。

1.2.2 ?試驗流程 ?按圖1組裝河豚毒素毒性傳感器。在35 ℃，pH 7.6，以 GGA質量濃度為21.5 mg/L的試驗底液穩定一段時間，記錄穩定后的電流值I0。然后將一定體積的毒素溶液加入底液中，等待新的平衡，記錄再次穩定后的電流值It，通過試驗可知電流的變化ΔI（ΔI=It–I0）與TTX的量成一定比例關系，得到TTX濃度～ΔI的線性關系曲線圖。

1.2.3 ?最優膜的設計 ?制備3種組合的微生物膜，組合比例分別為①10 μL濕菌體+0輔料、②10 μL濕菌體+1%輔料③10 μL濕菌體+2%輔料，分別組裝河豚毒素的毒性傳感器。試驗條件均為為：35 ℃、pH 7.6，底液中GGA質量濃度為21.5 mg/L[5]，進行如下3個試驗：

Ⅰ精密度測試：平行6次測定傳感器對質量濃度為50 μg/L TTX溶液的響應信號，計算測量的平均值、標準偏差及變異系數。

Ⅱ標準曲線的繪制：測定3種類型毒性微生物傳感器對不同濃度TTX溶液的響應情況，得到的標準曲線，線性響應范圍、線性方程及線性相關系數。

Ⅲ加標回收率試驗：取TTX樣品做加標回收率試驗。

1.2.4 ?高效液相色譜測試條件的選擇

1）流速的選擇。選擇流動相為醋酸和去離子水，設定總流速為8.000 mL/min，試驗醋酸流速為0.799、0.798、0.796、0.792、0.790、0.788、0.785、0.783、0.780 mL/min時基線穩定情況和TTX分離情況。

2）保留時間。流動相為醋酸和去離子水，在上述確定的流速下向液相色譜儀中注射濃度為50、75、100 μg/mL的TTX標準溶液，觀察液相色譜圖，確定其保留時間。

3）檢測波長的選擇。流動相為醋酸和去離子水，在上述確定的流速、保留時間下測定波長分別為220、225、230、235、240 nm 的出峰情況，找到在上述色譜條件下TTX的最大吸收波長。

2 ?結果與分析

2.1 ?傳感器方法最優膜的確定

3個試驗測試結果見表1，3種毒性傳感器的響應曲線見圖2。如表1及圖2所示，3種固定化方法的線性范圍都在10～80 μg/L之間，線性相關系數都在0.96以上;精密度和準確度都滿足毒性測量的要求，都可用于微生物傳感器對河豚毒素的毒性測試，但是加入1%輔料的微生物膜精密度高于其他配比的膜，線性相關系數也比其他配比膜好，制備的微生物膜性能優于其他配比的微生物膜，是這3種配比微生物膜中的較優膜。10 μL菌懸液加入1%的輔料是制備地衣芽孢桿菌毒性微生物膜過程中菌液與輔料的最佳配比。

2.2 ?HPLC條件的確定

試驗確定高效液相色譜條件為：ODS柱（150 mm×6 mm，5 μm），流動相為醋酸和去離子水，醋酸流速為0.798 mL/min，去離子水流速為0.002 mL/min，檢測波長230 nm;TTX保留時間為8.5 min;室溫。

2.3 ?HPLC標準曲線

配制濃度分別為10、20、45、50、75 100 μg/mL TTX系列標準溶液，按照“2.2”的色譜條件，各進樣10 μL，記錄在此色譜條件下各系列標準毒素的峰面積，以峰面積為縱坐標，河豚毒素濃度為橫坐標，繪制高效液相色譜法測定河豚毒素標準曲線見圖3。如圖3所示，TTX在濃度20～100 μg/mL范圍內線性關系良好，線性回歸方程為y=680.93x-4 544.20，相關系數為0.995 6。

2.4 ?兩種測試方法結果比較

在“2.2”確定的色譜條件下向液相色譜儀中注射10 μL未知濃度的TTX樣品，測定未知樣品的峰面積，利用圖3的標準曲線y=680.93x-4 544.20計算出樣品濃度;以最優膜組裝毒性傳感器，試驗測得未知樣品稀釋1 000倍后電流差值△I，標準曲線的回歸方程為y=0.002 5x+0.012 2，由此可以計算出稀釋后的樣品濃度，兩種測定方法對同一未知樣品的測定結果見表2。兩種測定方法的結果用SPSS軟件進行顯著性t檢驗，可知P>0.05，兩者的差異不顯著，兩種測定方法對樣品的測定結果有很好的一致性。

3 ?小結與討論

試驗測試了10 μL菌懸液加入0%、1%、2%3種微生物組裝的傳感器對河豚毒素的響應，結果表明，這3種微生物傳感器都可滿足微生物傳感器測試毒性的要求，10 μL地衣芽孢桿菌菌懸液加入1%輔料制膜組裝的傳感器性能最優。在實驗室自有的條件下，利用高效液相色譜法測定TTX的毒性，通過試驗得到最佳的色譜條件為：分析柱為ODS柱（150 mm×6 mm，5 μm），流動相：醋酸和去離子水，流速分別為0.798 mL/min和0.002 mL/min，檢測波長：230 nm;TTX保留時間為8.5 min;室溫;在此色譜條件下，測得TTX濃度在20～100 μg/mL范圍內線性關系良好，線性回歸方程為y=680.93x-4 544.20，相關系數為0.995 6。同時利用課題裝的地衣芽孢桿菌毒性微生物傳感器和高效液相色譜法測定未知濃度的TTX的毒性。通過結果對比，高效液相色譜法與微生物傳感器的測定結果有很好的一致性，試驗建立的微生物傳感器方法可以很好的測定河豚毒素濃度，但是仍有許多不足之處有待進一步研究，比如傳感器的穩定性和響應范圍，微生物膜固定化技術的優化等，可以作為下一階段研究的重點。

參考文獻：

[1] 段發淼，謝心磊，朱寶平.用小鼠單位法檢測河豚毒素[J].中國衛生檢驗雜志，2000，8（4）：463-464.

[2] 舒 ?靜，李柏林，歐 ?杰.離子色譜法定量檢測酒曲發酵液中的河豚毒素[J].色譜，2011（2）：187-190.

[3] 叢 ?蕾，王錫昌，劉 ?源，等.河豚毒素免疫抗原的制備及其表征體系的建立[J].中國預防獸醫學報，2010（6）：41-494.

[4] 黃 ?正，任 ?恕.微生物傳感器在污染物生物毒性分析中的應用[J].傳感器技術，2004，23（9）：4-6.

[5] 崔建升，陳 ?婧，王 ?芳，等.微生物傳感器測定河豚毒素研究[J].海洋環境科學，2009（6）：726-728.

[6] 陳唯真，朱維華，俞如英.HPLC法測定河豚毒素的含量及穩定性[J].藥物分析雜志，2004，24（1）：41-43.

[7] 劉海新，張 ?農，董黎明，等.柱后衍生高效液相色譜法測定水產品種河豚毒素的含量[J].水產學報，2006，30（6）：812-817.

[8] 張 ?虹，柳正良，黃蓓琳，等.反向離子對-高效液相色譜法測定河豚毒素[J].中國現代應用藥學雜志，2001，18（3）：197-198.