影響米粉干轉基因成分熒光PCR檢測的若干因素分析

江樹勛，張 冰，邵碧英，繆婷玉，彭 娟，陳文炳，*

(1.福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，福建省檢驗檢疫技術研究重點實驗室，福建福州 350001;2.福建農林大學，福建福州 350003;3.廈門塔斯曼生物工程公司，福建廈門 361023)

轉基因技術的產生使動植物、微生物等生物體性狀改良成為可能［1］，包括生長性能、抗病、抗逆性、營養品質［2］等。在中國，稻米產量占糧食總產量的40%，是過半中國人的主糧［3］，從1988年首個可育的轉基因水稻植株培育成功［4］，基因工程技術在我國水稻品種改良上得到了廣泛的研究。目前已經培育成功的轉基因水稻植株所攜帶的目的基因主要包括抗蟲、抗病、抗逆、抗除草劑和改善營養品質等類型［5］。鑒于轉基因產品安全性還未定性，世界各國仍將轉基因食品安全列為重點問題［6］。許多國家相繼制定了轉基因生物的管理法規，要求對轉基因產品進行標識［7］。挪威［8］是首個實行轉基因產品含量標識的國家，標識低限為2%:歐盟的標識低限［9］為1%。我國［10］于2001年5月23日頒布了《農業轉基因生物安全管理條例》，2002年3月20日開始貫徹實行《農業轉基因生物標識管理辦法》。

表1 熒光定量PCR引物/探針序列Table 1 The primer/probe sequence of fluorescence PCR

表2 引物、探針用量不同的3個PCR反應體系Table 2 Three PCR reaction systems of different dosage of primers and probe

目前轉基因檢測的對象已經從一般農產品擴展到深加工產品，如食用油脂、米制品、醬油、飼料等［11］，我國出口的米制品一直是歐盟等國家或地區檢測的重點［12］，對我國出口米制品影響很大。歐盟在2008年4月15日起對中國大米及其制品要求實施檢測并出具統一的衛生證書才能出口［13］。但在轉基因成分檢測中，通常情況下提取DNA時僅要求把原料研磨成粉，一般不對顆粒細度提具體要求，這種情況下的主要顆粒細度為50～100目，同時存在大量小于50目和小量大于100目的顆粒，對溫育時間要求一般是1h(如大豆)或以上(如大米等)，由于這些條件往往無法穩定滿足對深加工產品轉基因成分檢測的準確性。為此，本文針對影響深加工米制品轉基因成分檢測的實時熒光PCR［14-16］結果準確性的各種因素進行研究，建立了規范的技術操作程序，為保障我國進出口米制品安全提供了科學檢測依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

非轉基因大米與米制品米粉干(線狀)為企業送檢留樣，科豐6號轉基因大米樣品(含CaMV35S、Nos、Cry1Ab、Ub-c外源基因成分)由福建省農業科學院提供。CTAB十六烷基三甲基溴化銨;TE緩沖液、蛋白酶K與RNA分解酶等購自上海生工生物工程有限公司;Premix Ex Taq(2×)(Probe qPCR)試劑盒購自大連寶生物科技公司。大米內源基因(GOS)與外源基因［17］(CaMV35S、NOS、Cry1Ab、Ub-c)擴增用的引物與探針由大連寶生物科技公司合成(表1)。

高速冷凍離心機 日立公司;臺式離心機 德國Eppendorf公司;核酸蛋白分析儀 德國Amersham公司;PCR超凈工作臺 美國Labconco公司;ABI7500實時熒光PCR儀 美國Applied Biosystems公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 模擬轉基因米粉干樣品配制及DNA提取 按照四分法對每個非轉基因米粉干樣品分樣，稱取200g烘干研磨成細粉，分別制成＜50目、50～100目、＞100目3個細度范圍的樣品。相同方式制備科豐6號轉基因大米樣品，兩者按照相同細度和相應的質量分數，分別配制轉基因大米含量為1%、0.1%、0.01%、0.001%4個轉基因含量梯度的模擬轉基因米粉干樣品，比如同等粒度的99.99g非轉基因米粉干粉末與0.01g轉基因大米粉末充分混勻，制成質量分數為0.01%(m/m)的模擬轉基因米粉干。

采用 CTAB 法［18］提取 DNA。

1.2.2 熒光PCR反應體系與條件 設熒光PCR單管反應體積為20μL，引物與探針用量如表2。

實時熒光 PCR反應主程序為:95℃，10min;95℃，35s，60℃，60s，45 個循環。每個反應重復2 次。設置陰性對照、空白對照和陽性對照。閾值設定原則［19］根據儀器噪聲情況進行調整。

1.2.3 熒光PCR檢測 對不同含量和細度的108個樣本分別提取2份DNA，每個DNA做2個熒光PCR反應，即每個樣本做4個PCR重復，共檢測5個基因:大米內源基因(GOS)與外源基因 CaMV35S、NOS、Cry1Ab、Ub-c(Kefeng 6)，總共進行 2160 管PCR反應，每次(96孔板)實驗都設置陽性對照、非轉基因大米陰性對照與雙蒸水(ddH2O)空白對照［20］。

1.3 數據統計分析

采用Microsoft Office Excel 2003進行數據分析，對不同處理條件下樣品DNA質量濃度與內源和外源基因的實時熒光PCR檢測結果(Ct值)的差異顯著性進行方差分析，并估算邊際均值圖。

1.4 檢出率實驗

因檢驗檢疫領域通常認為熒光PCR轉基因成分的檢測限［21］為0.01%(轉基因含量0.01%樣品，檢出率達到95%以上)，本實驗擬在探究以上實驗得到的最優樣品前處理方法的基礎上，探究了進一步提高熒光PCR轉基因成分的檢出率，即選用轉基因含量為0.001%的米粉干樣品，實驗其檢出陽性樣品的百分率。

2 結果與分析

2.1 樣品顆粒細度及溫育時間對DNA提取效果影響

實驗設置了＜50目、50～10目、＞100目3個研磨顆粒細度和1、4、8h 3種CTAB溫育時間，表3為含量為0.01%的樣品提取的DNA濃度情況。

表3 米粉干樣品提取的DNA濃度(ng/μL)Table 3 The DNA concentration of rice noodle samples(ng/μL)

表3是米粉干樣品提取的9種處理組合下2個重復提取的DNA濃度平均數據，各個樣品的DNA質量經核酸蛋白分析儀測試，結果可知，DNA的OD260/OD280值都在1.7～2.0范圍內，符合 PCR 檢測要求［22］。但是在相同的顆粒細度下，提取到的DNA濃度隨著溫育時間的增長而增高，溫育時間達到8h條件下效果最好;在溫育時間相同情況下，DNA濃度隨樣品顆粒細度的增加而增高，顆粒大小為＞100目的樣品提取到的DNA濃度最高。方差分析結果表明，樣品顆粒細度與CTAB緩沖液溫育時間對樣品DNA提取濃度的影響均達到極顯著水準(F行=73.00，F列=65.53，F0.01=18.00，p ＜0.01)。

2.2 熒光PCR反應體系優化結果分析

2.2.1 引物、探針用量對檢測結果準確性的影響實驗樣品DNA為0.01%轉基因大米含量的米粉干樣品在研磨細度50～100目，CTAB緩沖液溫育時間達到8h條件下提取的DNA，測定3種引物、探針用量體系下內源基因和外源基因實時熒光PCR的Ct值，每個基因做4個重復。結果如表4。

表4結果顯示，PCR反應體系2測得的Ct值均比體系1和體系3的Ct值小，效果最好。

2.2.2 DNA模板濃度對檢測結果準確性的影響 采用2.2.1中的DNA原液及2倍和6倍稀釋液進行體系2實驗，測定了3個DNA濃度梯度樣品的內源基因 GOS和外源基因 CaMV35S、NOS、Cry1Ab熒光PCR的Ct值。結果如表5。

表4 不同引物、探針用量下4個基因熒光PCR檢測結果(Ct值)Table 4 Fluorescence PCR detection results(Ct value)of 4 genes under different dosage of the primers and probe

表5 不同DNA濃度下4種基因熒光PCR檢測結果(Ct值)Table 5 Fluorescence PCR detection results(Ct value)of four genes under different concentration of DNA

從表5可以看出，DNA用量對檢測結果的Ct值影響明顯。DNA用原液時PCR檢測結果的Ct值最小，效果最理想。即DNA濃度較高時，Ct值相對較小，有利于提高熒光PCR檢測結果準確性。

2.3 不同含量梯度樣品對檢出結果的影響

對不同轉基因含量的米粉干樣品進行熒光PCR檢測，結果Ct值整理后利用SPSS數據分析軟件進行方差分析F檢驗，分析目數和溫育時間兩種因素間及兩種因素的交互作用對實驗結果影響的顯著性。同時利用Microsoft Office Excel 2003軟件對Ct值進行邊際均值估算，分析最優處理組合。

由表6對4種轉基因含量大米樣品F檢驗結果表明，目數因素對0.001%含量的 CaMV35S、1%和0.1%含量的GOS影響不顯著，0.001%含量的NOS影響較顯著，其它均有極顯著影響;時間因素對1%含量的CaMV35S、0.01%含量的NOS和0.001%含量的Cry1Ab的影響較顯著，其它均有極顯著影響;兩因素間交互作用對1%、0.1%含量的GOS無顯著影響，僅對0.01%、0.001%含量情況下的GOS有極顯著影響，對1%和0.1%的CaMV35S、NOS、Cry1Ab以及0.1%的Ub-c有極顯著影響。

表6 米粉干樣品F檢驗Table 6 F test of dry rice noodle samples

以0.01%轉基因含量米粉干樣品為例，其4個外源基因檢測結果的估算邊際均值圖如圖1～圖4所示:

圖1 0.01%轉基因含量米粉干CaMV35S估算邊際均值Fig.1 Estimating marginal average figure of CaMV35S of 0.01%GM rice noodles

圖2 0.01%轉基因含量米粉干NOS估算邊際均值Fig.2 Estimating marginal average figure of NOS of 0.01%GM rice noodles

圖3 0.01%轉基因含量米粉干Cry1Ab估算邊際均值Fig.3 Estimating marginal average figure of Cry1Ab of 0.01%GM rice noodles

可見，對于4個外源基因Ct值最小時對應的樣品前處理條件都是樣品顆粒細度＞100目和溫育時間8h，其他不同轉基因含量米粉干樣品Ct值的估算邊際均值圖與此結論基本一致(圖略)，由此可確定米粉干樣品前處理的最佳組合是樣品顆粒細度＞100目和溫育時間8h。

圖4 0.01%轉基因含量米粉干Ub-c估算邊際均值Fig.4 Estimating marginal average figure of Ub-c of 0.01%GM rice noodles

2.4 檢出率實驗

以轉基因含量為0.001%的米粉干樣品進行檢出率實驗，測定外源基因CaMV35S、NOS、Cry1Ab的Ct值，結果如表7所示:

表7 轉基因含量0.001%的米粉干樣品檢出結果Table 7 Detection results of rice noodle samples with 0.001%content of genetically modified rice

表7表明，恰當的前處理措施可以使得檢出限(以檢出率大于95%為指標)降低到轉基因含量0.001%，且PCR檢測的Ct值平均數(n=48)都在陽性結果判斷值(36)以下(表8)。

表8 經最優前處理后的米粉干模擬樣品轉基因成分Ct平均值Table 8 Average Ct values of transgenic components in simulated rice noodle samples after the optimum pre-treatment

3 結論

本文以模擬轉基因深加工米粉干為研究材料，探討了熒光PCR反應體系、樣品顆粒大小和DNA提取中樣品在CTAB緩沖液中的溫育時間對樣品DNA提取效果和熒光PCR檢測轉基因成分結果準確性的影響。

方差分析F檢驗結果表明，樣品顆粒細度與CTAB緩沖液浸泡溫育時間對DNA濃度產生的影響均達到極顯著水準，顆粒細度＞100目、CTAB緩沖液溫育時間達到8h的樣品提取的DNA濃度最高;不同處理條件下的大米內源基因GOS與4個外源基因的Ct值存在顯著或極顯著影響，不管哪個基因，從估算邊際均值圖可以看出樣品細度與CTAB溫育時間的最佳組合是樣品顆粒細度＞100目與CTAB緩沖液溫育時間8h。在此基礎上進行的檢出率實驗說明，前處理對檢出率有顯著影響，恰當的前處理措施可以使得檢出限(以檢出率大于95%為指標)降低到轉基因含量0.001%，是熒光PCR通常認為的檢出限0.01%的10倍，且PCR檢測的Ct值平均數(n=48)都在陽性結果判斷值(36)以下［參考轉基因檢測標準SN/T 2584-2010］。說明恰當的樣品前處理措施加上優化的熒光PCR反應體系條件可使不同轉基因含量樣品檢出效果更為理想，并能在一定程度上降低檢測限，這將對檢測相關產品的深加工轉基因食品的檢測具有重要參考意義，實踐證明應用該條件在對本實驗室檢測米粉干等深加工產品的轉基因成分中起到較好的效果。

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