多肋藻渣中褐藻膠提取工藝及其分離純化研究

李麗迪，王 迪，汪秋寬，侯 麗，何云海，宋悅凡，叢海花

(大連海洋大學國家海藻加工技術研發分中心，遼寧大連116023)

多肋藻(Costaria costata)屬于褐藻門、褐子綱、海帶目、海帶科、多肋藻屬，在亞洲主要分布于日本及朝鮮半島海域，是我國近年新栽培的褐藻［1］。多肋藻富含褐藻膠及多種人體必需的微量元素［2］，可食用，同時也是海藻工業的重要原料［3］。因多肋藻富含褐藻多糖硫酸酯，近些年對其的研究很多［4-5］，研究工作主要集中在多肋藻褐藻多糖硫酸酯與褐藻膠。多肋藻加工過程中會產生一些廢棄藻渣，含有數量可觀的褐藻膠，未見對多肋藻渣中有效成分的提取及分析相關研究與報道。因此本研究擬通過實驗研究多肋藻渣中褐藻膠的最佳提取工藝，以期為多肋藻的高效綜合利用奠定基礎，為實際的加工生產節約成本［6］。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

多肋藻渣 多肋藻提取褐藻多糖硫酸酯［7］后剩余的物質，冷凍保存備用;褐藻膠標準品 食品級，青島明月海藻集團有限公司提供;濃硫酸 國產優級純;95%乙醇 食用乙醇;其他試劑均 國產分析純。

Sartorius普及型pH計(PB-10) 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;HH-4型數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;LD5-2A型離心機 北京醫用離心機廠;ALPHAI-5型真空冷凍干燥機 德國制造;BS2000S型分析天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司;722S型分光光度計 上海分析儀器總廠;SBS-160型數控計滴自動部分收集器 上海滬西分析儀器廠;CL-1A型磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司;SZ-93型自動雙重純水蒸餾器 上海亞榮生化儀器廠;BT100-2J型恒流泵 保定蘭格恒流泵有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取工藝流程 稱取一定量多肋藻渣，加入一定濃度的碳酸鈉溶液浸泡，恒溫水浴加熱一定時間，離心(4500r/min，15min)取上清液，加入95%(體積分數，下同)的食用乙醇，至溶液中乙醇含量為30%，離心，將得到的沉淀進行冷凍干燥，得到的粉末即為褐藻膠［8-9］。

1.2.2 單因素實驗方法 在單因素實驗時，以褐藻膠粗得率為檢測指標，分析各因素對褐藻膠粗得率的影響。考察溫度對褐藻膠粗得率的影響時，控制體系的碳酸鈉濃度1%、料液比1∶25(g/mL)、提取時間5h，設置不同的提取溫度(50、60、70、80、90℃)。考察時間對褐藻膠粗得率的影響時，控制體系的提取溫度70℃，碳酸鈉濃度1%，料液比1∶25(g/mL)，設置不同的提取時間(2、3、4、5、6h)。考察料液比對褐藻膠粗得率的影響時，控制體系的提取溫度70℃，碳酸鈉濃度1%，提取時間5h，設置不同的料液比(1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45)。考察料液比對褐藻膠粗得率的影響時，控制體系的提取溫度70℃，料液比 1∶40(g/mL)，提取時間 5h，設置不同的碳酸鈉濃度(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%)。

1.2.3 正交實驗方法 在單因素實驗的基礎上，以多肋藻渣中褐藻膠的粗得率和純度為指標，采用4因素3水平正交設計探討多肋藻渣中褐藻膠的最佳提取工藝，正交因素水平表見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiments

1.2.4 得率和純度的計算 粗得率(%)=粗褐藻膠質量/多肋藻渣質量×100

純度(%)=咔唑硫酸法測定出的褐藻膠質量(g)/粗褐藻膠質量(g)×100

得率=粗得率×純度

提取物中褐藻膠含量的測定采用咔唑硫酸法［10］。冰水浴中向9mL 80%濃硫酸中加入0.4mL 0.1%的褐藻膠溶液，加水補至10mL，沸水浴30min后冷卻5min，加入0.3mL咔唑溶液，繼續沸水浴10min，冷卻后在530nm處測定吸光值;依褐藻膠標準曲線的回歸方程y=1.650x(R2=0.999)計算褐藻膠含量。

1.2.5 分離純化方法

1.2.5.1 D301-T弱堿性陰離子樹脂交換層析 采用D301-T弱堿性陰離子樹脂交換層析柱(φ2.6×30cm)純化。稱取一定量的褐藻膠溶解，先用0.2mol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液洗脫，再經0～2mol/L NaCl線性梯度洗脫，流速1mL/min，自動部分收集器進行收集，每管4mL，咔唑硫酸法跟蹤測定其褐藻膠含量，直到收集管中檢測不出褐藻膠為止。

1.2.5.2 Sephacryl S-300凝膠層析 色譜柱φ1.6×90cm、緩沖液為0.2mol/L pH7.5磷酸鹽緩沖液、速度為3mL/10min，每管3mL，標準品為藍色葡聚糖(Blue dextran，type 2000)，葡聚糖(Mr=4.41 × 104Da，6.67×104Da，1.35 ×105Da，Sigma)將 D301-T 純化褐藻膠得到的組分上柱，經過Sephacryl S-300凝膠層析，確定每個組分的相對分子質量范圍。

1.2.6 理化性質 色澤及性狀、pH、透光率和粘度測定采用GB 1976-2008，食品添加劑 褐藻酸鈉［11］中的測定方法;重金屬含量測定均采用國標中［12-13］的測定方法。

測定結果與GB 1976-2008，食品添加劑褐藻酸鈉相比較。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 不同提取溫度對褐藻膠粗得率的影響 提取溫度對褐藻膠粗得率的影響見圖1。隨著溫度的上升，褐藻膠的粗得率先增大后減小，當溫度達到70℃，褐藻膠粗得率達到最高，為15.88%。考慮到溫度過高時，可能導致大分子斷裂成小分子，影響得率［14-15］。因此選取 65、70、75℃作正交優化以確定最佳提取溫度。

圖1 提取溫度對褐藻膠粗得率的影響Fig.1 Influence of extracting temperature on the yield of sodium alginate

2.1.2 不同提取時間對褐藻膠粗得率的影響 提取時間對褐藻膠粗得率的影響見圖2。隨著時間的增加，褐藻膠的粗得率隨時間的增加而增加，5h以后，褐藻膠的粗得率有所下降。這可能是因為提取時間短，藻體不能完全破壞，反應不完全;而當提取時間超過5h，褐藻膠又有所降解，從而導致其得率偏低［16］。因此選取 4.5、5.0、5.5h 作正交優化以確定最佳提取時間。

2.1.3 不同料液比對褐藻膠粗得率的影響 料液比對褐藻膠粗得率的影響見圖3。隨著料液比的增大，褐藻膠的粗得率呈上升趨勢，并趨于平緩。當料液比為1∶40時，達到最佳的褐藻膠粗得率20.31%。適當的料液比能使原料中的褐藻膠得到充分提取，而且可減少溶劑的浪費，節省提取成本。因此選取1∶35、1∶40、1∶45 作正交優化以確定最佳料液比。

圖2 提取時間對褐藻膠粗得率的影響Fig.2 Influence of extracting time on the yield of sodium alginate

圖3 料液比對褐藻膠粗得率的影響Fig.3 Influence of Solid-Liquid Ratio on the yield of sodium alginate

2.1.4 不同碳酸鈉濃度對褐藻膠粗得率的影響 碳酸鈉濃度對褐藻膠粗得率的影響見圖4。隨著碳酸鈉濃度的升高，褐藻膠的粗得率呈上升趨勢，而后趨于平緩。當碳酸鈉濃度為3.5%時，粗得率最高。碳酸鈉濃度低時得率低，可能是因為藻體不能完全破壞，反應不完全;而且碳酸鈉溶液的濃度過高，會造成生產成本的提高，降低經濟效益。因此選取3.0%、3.5%、4.0%作正交優化以確定最佳碳酸鈉濃度。

圖4 碳酸鈉濃度對褐藻膠粗得率的影響Fig.4 Influence of Na2CO3 concentration on the yield of sodium alginate

2.2 正交提取條件的優化

在單因素實驗的基礎上，以褐藻膠粗提率和純度為指標進行L9(34)正交實驗，實驗結果見表2，驗證實驗見表3。

由表2中可以看出，以粗得率為指標的因素影響程度依次為:C、A、D、B，理論最佳組合為A2B3C3D2，而實驗最佳組合為A3B1C3D2;以純度為指標的因素影響程度依次為:C、B、D、A，理論最佳組合為A2B3C2D2，而實驗最佳組合為A1B2C2D2。

表2 褐藻膠提取工藝正交實驗結果Table 2 Orthogonal test results of extraction technology of alginate from Costaria costata residues

表3 褐藻膠提取最佳條件驗證實驗Table 3 The comparison analysis of the extraction of sodium alginate at the optimum conditions

為確定堿提法提取褐藻膠的最佳工藝參數，對組合A2B3C3D2和A2B3C2D2進件驗證。粗得率最高組為A3B1C3D2，但其純度最低;A1B2C2D2的純度和得率均最高，其粗得率最低。在綜合考慮下，選取A1B2C2D2作為實驗的最佳組合。因此，確定了堿提法提取褐藻膠的最佳工藝參數:提取時間4.5h、料液比1∶40、堿液濃度3.5%、提取溫度70℃，在該條件下水解，多肋藻渣中褐藻膠的粗得率為44.07% ±0.22%，純度為94.77% ±0.19%。在最佳提取工藝條件下進行中試生產供后期實驗使用。

2.3 分離純化研究

2.3.1 D301-T弱堿性陰離子樹脂柱層析 D301-T弱堿性陰離子樹脂柱層析洗脫曲線見圖5。由圖5可見，梯度洗脫后共有2個峰，分別稱為F1、F2，其中F1為未經鹽洗脫的流出峰，其回收率分別為19.33%和63.33%;褐藻膠含量分別為84.56%和89.69%。

圖5 D301-T梯度洗脫曲線Fig.5 The grading elution curve of alginate on D301-T column

2.3.2 Sephacryl S-300凝膠層析 通過藍葡聚糖標準品(Mr＞2.0×106)，以及葡聚糖標準品(Mr=4.41×104、6.67 ×104、1.35 ×105)，得到外水體積為87mL，相對分子質量標準曲線方程y=-2.5417x+5.5216，R2=0.9993。

將組分F1和F2分別經過Sephacryl S-300凝膠柱層析，進一步分離純化，并測定其相對分子質量。洗脫曲線如圖6、圖7所示。

圖6 F1的Sephacryl S-300凝膠柱層析圖譜Fig.6 Chromatogram of F1 with Sephacryl S-300 column

圖7 F2的Sephacryl S-300凝膠柱層析圖譜Fig.7 Chromatogram of F2 with Sephacryl S-300 column

由圖 6和圖 7可以看出，組分 F1，F2經Sephacryl S-300凝膠柱層析分別只得到一個對稱峰，這表明各組分組成均一、純度較高。F1的洗脫峰其相對分子質量為257ku;F2的洗脫峰其相對分子質量為81ku。

2.4 理化性質

檢測褐藻膠粗提物、組分F1和組分F2的理化性質，檢驗結果如表4。三者均溶于水，不溶于乙醇、甲醇等有機溶劑。根據GB 1976-2008，食品添加劑褐藻酸鈉中規定，褐藻膠、組分F1和組分F2的色澤、性狀、pH、透光率和重金屬含量均符合標準，但粘度過低，可能是因為多肋藻在提取褐藻多糖硫酸酯的過程中經過98℃高溫蒸煮導致褐藻膠的降解，這與盤茂東等［14］的研究結果相一致。

表4 理化性質Table 4 Physical and chemical properties

3 結論

褐藻膠是海帶、海藻、巨藻等所有褐藻屬中都含有的主要成分［17］。褐藻膠作為一種天然高分子物質以其良好的生物降解性和生物相容性，以及良好的增稠性、成膜性、穩定性、絮凝性和螯合性［18］而被廣泛應用于化學、生物、醫藥、食品等領域［18-22］。

利用多肋藻提取褐藻多糖硫酸酯后，剩余大量藻渣，既造成資源的浪費，又會對環境有一定的破壞。本文采用正交實驗方案研究了從多肋藻渣中提取褐藻膠的工藝研究，得出最佳的提取工藝條件是時間 4.5h、料液比 1∶40、Na2CO3濃度 3.5%、溫度70℃，褐藻膠的粗得率為44.07%，純度為94.77%。這說明用堿提法提取多肋藻渣中褐藻膠是可行的，而且得率和純度均較高。

褐藻膠F經D301-T弱堿性陰離子樹脂柱層析和Sephacryl S-300凝膠柱層析得到兩個單一組分，相對分子質量分別為257、81ku，這與其粘度測定結果相符。重金屬檢測顯示其含量均未超標。本文介紹的提取工藝流程簡單易行，成本低，適合于工業生產，對充分高效利用多肋藻有重要的理論和實踐意義。

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