血清對周期性張應變作用下成骨細胞凋亡的作用及機制研究

李 晅，王冬梅，沈 剛，唐國華(上海市口腔病防治院口腔正畸科，上海 0000;上海交通大學機械與動力工程學院;上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院口腔正畸科;上海市口腔醫學重點實驗室;通訊作者，E-mail:tangg@graduate.hku.hk)

細胞凋亡(apoptosis)，是指有核細胞在體內外因素觸發下，啟動自身內部機制，通過激活內源性DNA內切酶引起細胞的自然死亡。細胞凋亡清除受損傷的或衰老無用的細胞，保持細胞死亡和增殖的平衡。成骨細胞作為骨生長改建的效應細胞，在骨改建的機制中處于“中心調控地位”。成骨細胞凋亡速度對保持骨重建的平衡有重要作用［1］，研究發現在顱骨快速生長期的骨縫邊緣、骨折愈合期和牽張成骨過程中均發現有成骨細胞凋亡的發生［1-3］，早期出現在骨改建區域的成骨細胞中50%-70%無法分化為成熟的骨細胞參與成骨［4］。體外研究發現，去血清培養可以誘導成骨細胞凋亡，在此基礎上施加周期性張應變，不同大小和持續時間的周期性張應變對成骨細胞凋亡有不同的影響［4-7］。然而目前血清對周期性張應變作用下體外培養的成骨細胞凋亡的影響的研究結果尚不明了，也缺乏相應調控機制的研究。

本研究通過不同血清培養狀態下使用Flexcell 4000TM細胞應變加載系統對大鼠顱頂骨成骨細胞施加周期性張應變，研究血清對周期性張應變作用下體外培養的成骨細胞凋亡的影響，評價血清對成骨細胞凋亡的作用，并從其對細胞凋亡相關基因caspase的影響分析其中機制。

1 材料與方法

1.1 原代成骨細胞體外分離和檢測

取＜24 h新生SD大鼠，無菌條件下獲取顱頂骨，采用次序性酶消化法分離成骨細胞，加入含10%FBS(V/V)的MEM培養基，接種于75 cm2培養瓶，次日吸去殘留骨片后隔日換液，細胞90%匯合時傳為P1代。取P2代細胞，培養l周后多數細胞表現為堿性磷酸酶染色陽性;經含β-甘油磷酸鈉和抗壞血酸的培養基培養，2周后可形成明顯的礦化結節，茜素紅染色為鮮紅色，證實所獲成骨細胞具有體外成骨功能。本實驗采用P2-P4代的成骨細胞作為研究對象。

1.2 成骨細胞培養和周期性張應變加載

采用Flexcell 4000TM細胞應變加載系統(Flexcell公司，美國)培養和加載成骨細胞。將同一代次的成骨細胞以1×105/孔接種于細胞加力板，培養4 d后，更換培養液，施加變形率為6%或12%的周期性張應變，頻率為0.5 Hz，連續加載72 h。根據加力時使用培養液中血清含量分為血清組(+serum)和無血清組(-serum)。對照組采用相同培養方式，但不加力。

1.3 流式細胞儀檢測成骨細胞凋亡

細胞加力后即刻收獲細胞，運用AnnexinⅤ-FITC/PI(BD Pharmingen，美國)雙染色法及流式細胞技術檢測成骨細胞早期凋亡。將無血清對照組的凋亡率作為1，分別計算其余各組的凋亡比率。

1.4 ELISA法檢測caspase-3表達

細胞加力后即刻收獲細胞，用1 ml RIPA(上海博彩生物科技有限公司，中國)與100μl苯甲基磺酰氟(PMSF，sigma，美國)混合液于冰上裂解細胞。裂解后細胞蛋白液運用大鼠caspase-3 ELISA試劑盒(R＆D Systems，美國)描繪標準曲線并檢測，使用酶標儀(Safire2，瑞士)在450 nm處測吸光值。根據樣品OD值在已描繪的標準曲線圖上查出相應caspase-3含量。

1.5 real time PCR 法檢測 caspase-8，9表達

細胞加力后即刻收獲細胞，采用TRIZOL(Invitrogen，美國)法提取細胞總RNA，采用QuantiTect Rev.Transcription Kits試劑盒(Qiagen，德國)逆轉錄合成 cDNA，采用 QuantiTect SYBR Green PCR Kits(Qiagen，德國)于 ABI PRISM 7900實時定量 PCR系統(Applied Biosystems，美國)進行目的基因(caspase-8，9)real-time PCR定量分析。引物序列見表1，實驗操作按試劑盒說明進行，計算各測試基因與內參基因GAPDH比值，作相對量分析。

表1 real time RT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for RT-PCR

1.6 統計學分析

以上所有試驗均作3次重復，應用SAS 6.0軟件進行統計學分析，數據以±s表示，進行獨立樣本t檢驗。

2 結果

2.1 成骨細胞受周期性張應變作用后早期細胞凋亡分析

在含血清的培養液中，對照組成骨細胞與周期性張應變作用的成骨細胞均呈現較低水平的細胞凋亡，并且周期性張應變對成骨細胞凋亡的影響不顯著。在無血清的培養液中，對照組成骨細胞就呈現一定的凋亡比率，并與血清組成骨細胞凋亡比率有顯著差異(P＜0.01)，無血清組細胞在6%的周期性張應變作用72 h后，成骨細胞凋亡率為對照組的49%，兩者有顯著差異(P＜0.05)。而在12%的周期性張應變作用下，成骨細胞凋亡有顯著增加(P＜0.01)，為對照組的292%。在相同加力條件下，無血清組成骨細胞的凋亡比率較血清組有顯著增加，分別為 132%(6%周期性張應變，P＜0.05)和912%(12%周期性張應變，P ＜0.01，見圖1)。

圖1 周期性應變力作用下大鼠成骨細胞凋亡的定量分析Figure 1 Apoptosis of rat osteoblast after 72 h stretch loading

2.2 成骨細胞受周期性張應變作用后caspase-3的活性表達

在含血清的培養液中，對照組成骨細胞與周期性張應變作用的成骨細胞均呈現較低水平的caspase-3活性表達，并且周期性張應變對成骨細胞caspase-3表達的影響不顯著。在無血清的培養液中，對照組成骨細胞就呈現一定的caspase-3活性表達，并與血清組成骨細胞凋亡比率有顯著差異(P＜0.01)，無血清組細胞在6%的周期性張應變作用72 h后，成骨細胞 caspase-3活性表達為對照組的66%，兩者有顯著差異(P＜0.05)。而在12%的周期性張應變作用下，成骨細胞caspase-3活性有顯著增加(P＜0.01)，為對照組的156%。在相同加力條件下，無血清組成骨細胞較血清組的caspase-3活性有顯著增加(P＜0.01，見圖2)，分別為374%(6%周期性張應變)和777%(12%周期性張應變)。

圖2 周期性應變力作用下大鼠成骨細胞caspase-3活性表達分析Figure 2 Caspase-3 activity of rat osteoblast after 72 h of stretch loading

2.3 成骨細胞受周期性張應變作用后caspase-8，9的基因表達

成骨細胞在周期性張應變作用下，血清組和無血清組細胞的caspase-8表達呈現相似趨勢，6%的周期性張應變作用72 h后，成骨細胞caspase-8表達分別下調46%(血清組)和48%(無血清組)，與對照組差異顯著(P＜0.05)。在12%的周期性張應變作用下，成骨細胞caspase-8表達顯著增加(P＜0.05)，分別為對照組的1 006%(血清組)和768%(無血清組)。而相同加力條件下，血清組和無血清組成骨細胞caspase-8表達無顯著差異(圖3 A)。

血清組和無血清組成骨細胞在周期性張應變作用下，caspase-9組內表達無明顯差異。而在相同加力條件下，血清組成骨細胞較無血清組的caspase-9活性有顯著降低(P＜0.05，圖3B)，分別為51%(6%應變力)和43%(12%應變力)。

3 討論

在外界機械力刺激下，成骨細胞的反應是骨組織發生適應性改建的基礎［8］。成骨細胞體外應力加載為研究成骨細胞對機械力的生物學反應提供了可能。目前發現，不同的加力方式(如加載裝置，力值大小、加力時間、加力頻率等)會導致研究結果大相徑庭［9-12］。在相同的力學加載條件下，不同級別的機械牽張刺激—高(21%)、中(14%)和低(7%)—對成骨細胞分化水平影響有所不同［13］，且無血清培養條件中成骨細胞無法承受超過15%的周期性張應變作用，而不足24 h的力學刺激對成骨細胞凋亡作用不明確，另外1 Hz以上的作用頻率會增加張應變作用過程中的流體剪切效應［14］。綜合以上前人研究結果并根據原代成骨細胞的生長曲線，本研究選用對數生長期的結束時間點(4 d)的細胞進行力學加載分析。使用Flexcell 4000TM細胞應變加載系統，對成骨細胞施加均勻的等軸牽張力。采用了6%和12%兩個張應變參數，以0.5 Hz的頻率對細胞加載72 h的周期性張應變。根據加力時細胞培養液中是否含有血清分為血清組和無血清組。

圖3 周期性應變力作用下大鼠成骨細胞caspase-8(A)和caspase-9(B)的基因表達分析Figure 3 Gene expression of caspase-8(A)and 9(B)in rat osteoblasts after 72 h stretch loading

本研究結果顯示，在含血清的培養液中，成骨細胞均呈現較低水平的細胞凋亡，且周期性張應變對細胞凋亡的影響不顯著。在無血清的培養液中，對照組成骨細胞已呈現一定的凋亡比率，且明顯高于血清組(P＜0.01)，應力條件下，6%的周期性張應變抑制成骨細胞的凋亡，而12%的周期性張應變則促進成骨細胞的凋亡(圖1)。提示無血清狀態下，周期性張應變可以調控成骨細胞凋亡的發生，其中力值大小起重要作用，這與以往研究結果一致［7，12］。而血清的存在使得周期性張應變對成骨細胞凋亡的調控作用明顯減弱。而這一趨勢在caspase-3的活性檢測中也得到相似結果(見圖2)。目前在動物細胞培養中，血清起到很重要的作用，它能夠提供細胞生長必需的基本營養物質;提供激素和各種生長因子;提供結合蛋白攜帶重要的低分子量物質，在細胞代謝過程中起重要作用;提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷;對培養中的細胞起到某些保護作用;提供酸堿緩沖物質，調節培養基pH值;影響培養系統中的某些物理特性如:剪切力、黏度、滲透壓和氣體傳遞速度等［15］。研究證實，血清的存在與否對細胞凋亡表達水平有顯著影響，并且這種影響在不同種類細胞中呈現相似性［16-18］。

我們的研究結果還顯示，成骨細胞在周期性張應變作用下，血清組和無血清組細胞的caspase-8表達呈現相似趨勢，即6%的周期性張應變下調其表達而12%的周期性張應變促進其表達。而血清組和無血清組成骨細胞在周期性張應變作用下，caspase-9組內表達無明顯差異，但是在相同加力條件下，血清組成骨細胞較無血清組的caspase-9活性顯著降低(見圖3)，提示caspase-8表達與應力相關而Caspase9表達主要受血清影響。在caspase-家族中，與細胞凋亡相關的caspase-主要分為起始和執行 caspase-兩大類［18，19］，當細胞發生凋亡時，起始caspase-在外來蛋白信號的作用下被切割激活后，它對執行caspase進行切割并使之激活，被激活的執行者caspase通過對 caspase-靶蛋白的水解，形成caspase 級聯反應，促發細胞凋亡［20，21］。caspase 級聯反應主要涉及死亡受體途徑和線粒體途徑兩條途徑。死亡受體途徑主要由腫瘤壞死因子受體超家族激活caspase-8從而激活caspase級聯反應。而線粒體途徑則是細胞內部線粒體內分泌的細胞色素C誘發刺激激活caspase-9從而激活caspase級聯反應。而我們的研究結果提示，血清對成骨細胞凋亡比率的下調作用與caspase-級聯反應有關。根據結果，caspase-8的表達與血清的存在無相關性，而caspase-9和caspase-3的表達都因血清的存在而下調，說明血清主要是通過caspase-9/3的途徑對成骨細胞凋亡產生影響。而caspase-9/caspase-3的途徑則主要涉及細胞內部線粒體內分泌的細胞色素C，由此可推得血清對成骨細胞凋亡的保護作用主要是通過抑制細胞內線粒體分泌細胞色素C從而下調caspase-9的表達。

綜上所述，無血清狀態下周期性張應變對成骨細胞的凋亡有影響，血清對周期性應變力影響的成骨細胞的凋亡有減弱作用。由此提示，成骨細胞的凋亡在應力介導的骨改建中發揮著重要作用。闡明成骨細胞凋亡的生物學機制，將有助于充分認識臨床上骨重建的過程和指導骨質疏松、骨折愈合的綜合治療。通過細胞因子、基因誘導等方法調控成骨細胞的凋亡，可能成為將來治療骨骼疾病和促進骨重建修復的一條有效途徑。

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