一個中國Gilbert綜合征家系的UGT1A1基因診斷

孫 健，尹 丹，毛 君，陳 瑛(南京醫科大學附屬蘇州醫院產科，蘇州 500;南京醫科大學附屬蘇州醫院新生兒科;通訊作者，E-mail:cyandzh@sohu.com)

Gilbert綜合征(Gilbert syndrome)是血液中非結合膽紅素顯著增高而發生黃疸的一類良性遺傳性疾病［1］。正常人的膽紅素經單核-巨噬細胞系統產生后與白蛋白結合，轉運到肝細胞表面后被肝細胞攝取、內化固定并轉運到肝微粒體，在膽紅素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶(UGTA1)作用下，一個或兩個葡萄糖醛酸基結合到膽紅素分子側鏈上，生成兩種結合膽紅素，即膽紅素單葡萄糖醛酸酯和膽紅素二葡萄糖醛酸酯，并排泌到膽道系統中［2］。

膽紅素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶(UGT1A1)是肝臟結合膽紅素的關鍵酶，在催化和排泄膽紅素過程中具有至關重要的作用，UGT1A1基因異常可導致肝臟微粒體的膽紅素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶表達下降，從而引起膽紅素代謝障礙。國外報道UGT1A1基因有很多突變型，在高加索人和非洲人中，在UGT1A1的啟動子TATA盒中一般有 TA插入，使正常 A(TA)6TAA突變為A(TA)7TAA［3］，在亞洲人中，變異更多發生在編碼區，該變異有的為純合性，而有的為雜合性。因此該疾病的遺傳特征是常染色體隱性遺傳還是常染色體顯性遺傳還存在爭議［4，5］。國外報道其發病率為3%-10%［6］。本研究對1例Gilbert綜合征患者及其家系進行致病基因突變位點檢測，明確該家系的發病機制。

1 對象和方法

1.1 樣本來源

先證者(Ⅲ1)，女，28歲，體檢發現總膽紅素升高至49.1 μmol/L，直接膽紅素和間接膽紅素都偏高，谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶等肝功能指標正常，查肝、膽、胰、脾B超未見異常，查血常規示血紅蛋白122 g/L，其余血常規指標基本正常，查網織紅細胞示0.059 8，基本排除血液科溶血性疾病。

家系調查(見圖1):家族4代，共4人有癥狀，先證者(Ⅲ1);先證者外公(Ⅰ1)有皮膚鞏膜黃染，但是外公拒絕抽血化驗血生化全套;先證者之姨(Ⅱ5)也有皮膚鞏膜黃染情況，總膽紅素偏高;先證者之女(Ⅳ1)出生第2天溶血性黃疸，總膽紅素嚴重偏高，2周歲總膽紅素仍偏高。根據流行病調查結果排除其他疾病，調查前每位成員都做到知情同意，并與所有采血對象簽署知情同意書。

圖1 患者一家4代家系圖Figure 1 The pedigree of Gilbert syndrome’s family

1.2 引物設計及合成

設計UGT1A1基因啟動子區域TATA盒及5對外顯子及側翼部分內含子序列，用于鑒定該家系UGT1A1基因突變情況，所設計的引物見表1，全部引物均由上海捷瑞生物工程有限公司(Generay)生物技術有限公司合成，使用濃度均為1 μmol/L。

表1 擴增UGT1A1外顯子引物序列及產物長度Table 1 The prim er sequence for am p lifying the exons of UGT1A1 gene and length of product

1.3 基因組DNA制備及PCR擴增

用QIAGEN公司試劑盒提取外周全血基因組DNA，操作方法按試劑盒說明書。以基因組DNA作為模板進行PCR擴增。反應體系為50-80 ng基因組 DNA，10 × buffer 1.0 μl，上下游引物各 1.0 μl，dNTP(2 mmol/L)1.5 μl，MgCl2(25 mmol/L)1.0 μl，FAST-Taq 酶(Roche 公司)0.15 μl，補充雙蒸水至10 μl。PCR反應在ABI9600熱循環儀上完成，反應條件為touchdown程序，95℃預變性3 min，94℃變性30 s，68℃退火50 s，72℃延伸1 min;以后每個循環退火溫度依次降低0.5℃，直到63℃，共11個循環;94℃變性30 s，63℃退火50 s，72℃延伸1 min，共24個循環;72℃延伸10 min。

1.4 PCR產物純化和測序

取3 μl PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收純化特異性片段并使用引物測序。PCR擴增產物純化后分別采用擴增用引物進行測序。1號外顯子擴增產物包括基因啟動子區域的TATA盒部分，測序儀為ABI3130。所有測序結果采用FinchTV軟件進行綜合分析。

2 結果

2.1 血清膽紅素水平

該Gilbert綜合征家系成員血清膽紅素水平見表2。先證者(Ⅲ1)及其女兒(Ⅳ1)、姨姨(Ⅱ5)的膽紅素水平均升高。

表2 Gilbert綜合征家系成員血清膽紅素水平(μm ol/L)Table 2 The serum bilirubin level of Gilbert syndrome’s family members(μmol/L)

2.2 PCR 擴增

啟動子TATA盒與外顯子 PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，電泳條帶是目的條帶，并且條帶唯一(見圖2)。

圖2 PCR擴增產物電泳圖Figure 2 Electrophoretogram of PCR products

2.3 啟動子TATA盒測序結果

對啟動子TATA盒序列的掃描結果顯示該家系UGT1A1基因啟動子存在TA插入突變，即由正常的A(TA)6TAA突變為A(TA)7TAA。先證者Ⅲ1和Ⅱ5為突變雜合子(見圖3)。

圖3 家系成員UGT1A1基因啟動子TATA盒測序結果Figure 3 The sequence results of UGT1A1 gene promoter TATA box of family members

2.4 外顯子測序結果

Ⅱ5的UGT1A1的1號外顯子第211位的鳥嘌呤(G)突變為腺嘌呤(A)，為雜合突變，導致編碼產物中第71位甘氨酸變為精氨酸(p.G71R)(見圖4)。

圖4 家系成員UGT1A1基因外顯子突變位點測序結果Figure 4 Sequence results of site mutation in exons of UGT1A1 gene of family members

2.5 G71R錯義突變位點多物種比較

通過Uniprot蛋白質數據庫對突變位點(第71位)，進行多物種的氨基酸序列比對分析，發現在比較的7種物種中非常保守，第71位均為甘氨酸G(見圖5)，此位點的錯義突變容易引起蛋白質功能上的改變，從而引起膽紅素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶的活性下降。

圖5 G71R錯義突變位點進化上保守性分析Figure 5 Conservation analysis in evolution of G71R missense mutation

3 討論

Gilbert綜合征的發病原因主要是UGT1A1基因發生缺陷。UGT1A1基因的突變類型較多，且不斷有新的突變類型被發現，血清非結合膽紅素增高幅度的差異也較大［4，7］。國內報道的家系也不多，而且UGT1A1基因的突變類型也各不一樣［8-12］。

本研究中，先證者Ⅲ1和Ⅱ5存在UGT1A1基因啟動子TA插入突變，且均為雜合突變;Ⅱ5還存在編碼區雜合突變(p.G71R)，而先證者不存在編碼區突變，這也是Ⅱ5的總膽紅素高于先證者的原因。

UGT1A1基因啟動子TATA盒中TA堿基序列插入突變，遺傳方式為常染色體遺傳，但是遺傳特征是常染色體隱性遺傳還是常染色體顯性遺傳還不確定［5］。啟動子區域緊靠第1外顯子轉錄起始點上游，包括TATA盒啟動序列，TATA盒是轉錄因子ⅡD的結合部位，在轉錄起始上起重要作用。如果存在更長的TATAA原件，會導致報告基因的表達降低［3］，A(TA)7TAA/A(TA)7TAA 和 A(TA)7TAA/A(TA)6TAA雜合的基因型與野生型A(TA)6TAA/A(TA)6TAA相比啟動子活性降低，轉錄效率下降，UGT1A1基因的表達能力下降，從而使酶活性減低，導致個體血清中膽紅素水平增高。日本一項研究分析了患者與正常對照者的膽紅素水平，結果顯示基因型為A(TA)7TAA/A(TA)7TAA突變純合子者，平均膽紅素水平分別為 37.7 μmol/L 和 16.2 μmol/L，基因型為A(TA)7TAA/A(TA)6TAA突變純合子者，平均膽紅素水平分別為 30.6 μmol/L 和10.7 μmol/L，正常野生型者平均膽紅素水平分別為19.6 μmol/L 和 9.5 μmol/L［13］。

Koiwai等［14］1995 年報道了外顯子1 的 p.G71R突變，此位點突變在日本人、韓國人及我國人群中最常見［15］。對p.G71R突變位點進行進化上保守性分析發現，此位點在人、大鼠、小鼠、黑猩猩、東非狒狒等物種中非常保守(見圖5)，都為鳥嘌呤(G)，如果突變成腺嘌呤(A)會導致UGT1A1結構異常，從而發生基因的功能缺陷。國內宋華等［8］也有此位點突變的報道。

值得注意的是，UGTlAl基因突變在Gilbert綜合征發病過程中雖起主要作用，但仍不可忽視其他的原因。有些人即使有TATA盒中TA堿基序列插入突變和G71R突變，但膽紅素水平仍維持在正常范圍，可能與體內其他基因上調UGTlAl表達，彌補該基因突變導致的缺陷有關;Gilbert綜合征也可能與microRNA有關，最近有研究發現MicroRNA491-3p能夠抑制 UGT1A1 的表達［16］，MicroRNA491-3p 可以作用于UGT1A1的3’UTR區，并且對UGT1A1的mRNA水平起抑制作用;還有研究發現發生在苯巴比妥反應增強元件的c.-3279T＞G突變也會影響UGT1A1的表達［17］。這都充分說明了Gilbert綜合征發病機制的復雜性。

Gilbert綜合征為先天性良性疾病，預后較好，一般無需特殊治療，因此早期診斷更有意義，可避免過度治療給患者及家屬帶來不必要的精神壓力和經濟負擔。而且通過對我國更多人群UGT1A1基因的檢測，進行基因突變數據的積累，對明確闡述我國人群Gilbert綜合征的發病機制和對指導黃疸患者的診斷和遺傳咨詢以及實現個體化用藥等都具有重要意義。

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