1型糖尿病大鼠腎小管間質纖維化的病理改變

郭淑香，孫冬梅，薛瑞鳳，李 靜，李會學(唐山工人醫院分院內科，唐山 06000;河北聯合大學附屬醫院超聲科;唐山市婦幼保健院超聲科;河北聯合大學附屬醫院超聲科;通訊作者，E-mail:sundongmeicui@6.com)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者臨床常見而難治的微血管并發癥，是導致終末期腎病和DM患者死亡的主要原因［1］。典型的 DN多見于 1型 DM，幾乎50%的1型DM患者合并DN，30%的1型DM死于腎功能衰竭［2］。腎小球和腎小管肥大是DN早期的主要病理表現，近來越來越多的研究認為，腎小管間質纖維化是慢性腎臟疾病進行性發展的重要病理基礎，它比腎小球硬化更能反映腎臟受損的程度［3］。本實驗通過腹腔注射鏈尿佐菌素(STZ，65 mg/kg)建立SD大鼠1型DM模型，觀察其早期腎小管及其間質的病理變化，并探討其在DN的發生、發展中的意義。

1 材料與方法

1.1 糖尿病大鼠模型的制備及分組

8周齡 SPF級健康雄性 SD大鼠50只，體重180-210 g，平均(199.64 ±11.04)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號:SCXK(京)2009-0004，飼養于河北聯合大學屏障環境動物實驗室(使用證明編號:MY06DXK07)，飼料為清潔級大小鼠生長顆粒飼料，購自北京科澳協力飼料有限公司(許可證號:SCXKK(京)2005-0007)。抽簽法隨機選取32只按劑量65 mg/kg腹腔注射鏈尿佐菌素(streptozotocin，STZ)(Sigma公司)。3 d及 7 d后，斷尾法用ACTIVE血糖儀(上海羅氏公司)測血糖，將血糖穩定大于16.7 mmol/L，尿糖持續陽性者定為糖尿病大鼠模型。除去未成模4只及死于急性并發癥大鼠10只，余下的隨機分為4周、12周、24周組，每組6只;同時選取同周齡大鼠各6只作為正常對照組，正常對照組18只大鼠無死亡。

1.2 標本采集

腹主動脈放血處死動物，立即取腎皮質組織2塊放入2.5%戊二醛中，用于透射電鏡觀察超微結構。其余腎臟組織放入10%中性福爾馬林液中固定，用于組織形態學觀察(HE、Masson染色)及免疫組織化學染色。

1.3 蘇木素-伊紅染色(HE染色)

切片常規脫蠟至水，蘇木素染色，伊紅染色，中性樹膠封固。

1.4 膠原染色及計算方法

膠原染色采用Masson三色染色(福州邁新公司)方法。用圖像采集系統(Olympus公司)采集圖像。應用Motic Med數碼醫學圖像分析系統(深圳麥克奧迪實業有限公司)，測量腎臟間質血管周圍膠原面積(perivascular collagen area，PVCA)、腎小管間質病變評分(tubulointerstitial lesion score，TILS)［4］。

計算方法:PVCA=間質小動脈管腔周圍膠原面積/該小動脈管腔面積，每組取12張切片，每張切片從腎皮質自外向內，自上向下隨機取10-15個視野，取其均值;TILS由3個參數判定(小管擴張和蛋白管型;炎癥細胞浸潤;間質纖維化)，每個參數按0-3分評定(0為正常，l為輕度受損，2為中度受損，3為重度受損)，每個樣本小管間質的評分為0-9分，每張切片隨機選擇10-15個不含腎小球的視野。以上分析圖像均在200倍光鏡視野下進行。

1.5 免疫組化染色測定collagaenⅠ、collagaenⅢ的蛋白表達

石蠟切片 collagaenⅠ、collagaenⅢ采用復合消化液酶修復，分別滴加濃度1:100稀釋一抗(Rabbit anti-collagaenⅠ、collagaenⅢ、TGF- β1，武漢博士德公司)，放入4℃冰箱過夜。再依次滴加生物素化山羊抗兔IgG，試劑SABC，DAB顯色，以胞質內棕黃色細顆粒為陽性信號。每組取12張切片，每張切片隨機取10-15個200倍顯微鏡視野圖像，測定平均積分光密度(intergrated optical density，IOD)。

1.6 透射電鏡標本制備

腎臟組織脫水，浸透聚合。超薄切片2%醋酸鈾染色，枸櫞酸鉛染色，透射式電子顯微鏡(日立H-7650)觀察攝片。

1.7 統計學分析

全部數據均以Excel建庫，通過SPSS13.0軟件包進行統計學分析。計數資料進行χ2檢驗，計量資料數據以±s表示，各組間比較采用隨機區組設計的方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況觀察

與對照組比較，糖尿病組大鼠多飲、多尿，精神萎靡，活動減少，毛發枯黃、無光澤，明顯消瘦，空腹血糖、腎臟質量指數(KWI)明顯增加，體重下降，差異有統計學意義(P＜0.05，見表1)，第6周肉眼下觀察可見白內障，6個月時均有白內障。正常對照組大鼠精神狀態良好，體重增加，毛皮有光澤，動作自如，反應靈敏，未發現有白內障，空腹血糖無明顯變化。

表1 各組大鼠空腹血糖、體重、腎重、腎臟質量指數比較(±s)Table 1 Comparison of body weight，fasting blood glucose，and kindney weight at different time between two groups(±s)

表1 各組大鼠空腹血糖、體重、腎重、腎臟質量指數比較(±s)Table 1 Comparison of body weight，fasting blood glucose，and kindney weight at different time between two groups(±s)

腎臟質量指數(KWI)=KW/BW;與同周齡對照組比較，*P＜0.05;與同組別4周比較，△P＜0.05;與同組別12周比較，#P ＜0.05

指標 組別 n 4周 12周 24周FBG/(mmol/L) 對照組65.21 ±0.51 5.03 ±0.32 5.38 ±0.54糖尿病組 6 27.70 ±2.54* 28.01 ±3.02* 25.48 ±3.11*體重/g 對照組 6 293.00±19.11 447.50±12.89△ 526.33±39.29△#糖尿病組 6 233.67 ±26.22* 273.00 ±14.56* 307.33 ±12.70＊△#腎重/g 對照組 6 1.20±0.14 1.90±0.14△ 2.11±0.17△#糖尿病組 6 1.11±0.19 2.04±0.14△ 2.13±0.06△腎臟質量指數*/(mg/g) 對照組 6 4.11 ±0.24 4.26 ±0.21 4.01 ±0.08糖尿病組 6 4.74±0.31* 7.49±0.13＊△ 6.95±0.21＊△#

2.2 光鏡下HE染色結果

結果:細胞質、基底膜、膠原纖維、肌纖維呈不同程度紅色，細胞核呈紫藍色。對照組大鼠腎小管上皮細胞大小一致，排列整齊，基底膜完整。糖尿病組大鼠4周時可見腎小管上皮細胞萎縮、脫落、空泡變性、管腔擴張，間質炎性細胞浸潤，隨病程進展，出現腎小管基底膜不規則增厚，膠原成分增多，小血管硬化(圖1，見第79頁)。

2.3 Masson染色膠原形態定性分析

結果:膠原纖維呈藍色，肌纖維呈紅色，細胞核呈藍褐色。對照組大鼠膠原沉積主要在腎小管周圍呈細線樣分布。DM組血管周圍膠原增密，且較長距離延伸至間質中，腎小管周圍的膠原增多，不規則排列連結成片狀或團塊狀，隨著病程進展而加重(圖2，見第79頁)。DM組的PVCA、TILS均顯著高于同期對照組(P＜0.05)，隨著病程進展，DM組上述指標逐漸增高(P＜0.05，見表2)。

表2 各組大鼠腎臟纖維化指標比較(±s)Table 2 Changes of indicies of renal fibrosis at different time in two groups(±s)

表2 各組大鼠腎臟纖維化指標比較(±s)Table 2 Changes of indicies of renal fibrosis at different time in two groups(±s)

與同周齡對照組比較，*P＜0.05;與同組4周比較，△P＜0.05;與同組12周比較，#P＜0.05

指標 組別 n 4周 12周 24周TILS/分 對照組 6 0±0.10 0±0.10 1±0.30△糖尿病組 6 1.50±0.50* 3±0.80＊△ 4.50±0.90＊△#PVCA/% 對照組 6 0.45±0.07 0.60±0.06△ 0.72±0.07△糖尿病組 6 0.96±0.11* 1.65±0.18＊△ 2.63±0.40＊△#ColⅠ/(×103/μm2) 對照組 6 1.34±0.34 2.17±0.12△ 3.01±0.33△#糖尿病組 6 4.56±0.75* 6.07±0.74＊△ 7.22±0.19＊△#ColⅢ/(×103/μm2) 對照組 6 1.58±0.24 2.95±0.41△ 3.27±0.27△糖尿病組 6 4.68±1.41* 6.60±0.30＊△ 8.25±0.18＊△#

2.4 腎臟組織中collagenⅠ、collagenⅢ的表達

對照組中，Ⅰ型膠原著色于腎間質，呈微弱陽性，DM組Ⅰ型膠原主要在細胞間質呈線狀分布，腎小管上皮細胞可見陽性，隨病程進展逐漸增高(圖3，見第80頁);對照組中，Ⅲ型膠原主要在細胞間質和胞質分布，在血管平滑肌細胞亦有表達，呈弱陽性，DM組主要位于腎間質，圍繞在萎縮的腎小管周圍，或散在于纖維化的腎間質中，或在血管平滑肌細胞及血管腔周圍，部分腎小管上皮細胞呈強陽性(圖4，見第80頁)，隨病程進展逐漸增高。與對照組比較，糖尿病各組CollagenⅠ、CollagenⅢ表達均明顯增加(P ＜0.05，見表2)。

2.5 超微結構觀察

對照組腎小球毛細血管基底膜厚度均一、平滑，腎小管結構清晰。糖尿病組毛細血管基底膜彌漫性增厚，足突融合，近曲小管上皮細胞空泡化，間質內膠原微纖維出現，隨時間進展逐漸加重(圖5，見第80頁)。

圖1 造模成功后12周大鼠腎臟HE染色 (×200)Figure 1 HE staining of kidney of normal rats and diabetes rats at week 12 after successful inducing DM models (×200)

圖2 造模成功后12周大鼠腎臟Masson三色染色 (膠原呈藍色，×200)Figure 2 Masson staining of kidney of normal rats and diabetes rats at week 12 after successful inducing DM models (×200)

圖3 造模成功后12周collagenⅠ免疫組織化學染色 (棕黃色物質為陽性反應，×200)Figure 3 Immunohistochemistry for collagenⅠin kidney of normal rats and diabetes rats at week 12 after successful inducing DM models (×200)

圖4 造模成功后12周collagenⅢ免疫組織化學染色 (棕黃色物質為陽性反應，×200))Figure 4 Immunohistochemistry for collagenⅢin kidney of normal rats and diabetes rats at week 12 after successful inducing DM models(×200)

圖5 造模成功后12周大鼠腎臟超微結構 (×8 000)Figure 5 Ultra structure of kidney of normal rats and diabetes rats at week 12 after successful inducing DM models(×8 000)

3 討論

本研究應用大劑量STZ一次性腹腔注射，破壞大部分胰島β細胞功能，致胰島素絕對缺乏，血糖快速升高，并維持高水平，類似人類1型糖尿病發生、發展過程。細胞外基質積聚和基底膜增厚是DN特征性的病理改變。過去認為DN主要病理改變在腎小球，對于腎小管間質病變的研究則重視不夠。近年研究顯示，糖尿病在腎小球濾過膜發生變化的同時甚至之前，小管間質已發生病變，說明腎小管及間質病變并不完全依賴腎小球病變，其本身也是導致 DN 的獨立因素之一［5］。有研究［6］證實，在DN的病理改變中，1/3的病人無腎小球病變，表現為明顯的腎小管細胞和腎間質損害;1/3的病人表現為典型的腎小球病變同時存在微量蛋白尿;其他1/3的病人則無腎臟結構變化。安娜等［7］的的臨床研究中也發現，在DM患者中反映腎小管功能的酶學指標要比反映腎小球功能的白蛋白更加敏感。朱雪婧等［8］的研究結果證實:DN中腎小管的病變可不依賴于腎小球的病變，有一定程度的獨立性。

本研究表明，動物在注射STZ后72 h血糖即明顯升高，且在整個實驗過程中血糖持續在高水平，大鼠多飲、多食、多尿及消瘦等現象，而且，在光鏡和電鏡下可見DM大鼠腎臟在病程4周時即出現了腎小管擴張和腎小管上皮細胞上皮細胞萎縮、脫落、空泡化，并隨著病程進展受損腎小管數量增多，腎小管基底膜增厚及小管間質纖維化。這意味著在DM早期腎小管本身已經發生了病變，而不是繼發于腎小球損害。

腎組織纖維化是DN的病理性特征改變，貫穿了整個DN病程并最終演變成終末期腎病。腎小管間質纖維化(renal tubulointerstitial fibrosis，TIF)是糖尿病腎病發展至終末期腎病必經的病理過程，近期研究發現，腎小球疾病的長期預后及腎功能改變與腎小管間質損傷程度密切相關［9，10］，其中腎小管損傷是TIF的主要起動因素［11］。但是，對于腎小管間質的發病機制研究不是十分清楚。目前多數學者已達成共識，各種不同的致損因子均通過調節3個基本的環節發揮作用:TEC(腎小管上皮細胞)增生與凋亡;ECM(細胞外基質)沉積與降解;TEC表型轉化。其中，以細胞外基質(ECM)積聚為主要病理基礎，ECM的主要成分是膠原纖維(Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原)，Masson染色是常用的膠原纖維(主要為Ⅰ、Ⅲ膠原蛋白)染色方法，本研究應用腎臟間質血管周圍膠原面積(PVCA)、腎小管間質病變評分(TIDS)來評價腎小管間質纖維化情況。結果 顯示:由DM第4周開始，HE染色已可見明顯的病理變化，Masson定性分析顯示自第4周起，DM組膠原含量明顯高于對照組，這是DN的直接證據。超微結構亦可見DM組隨病程腎小球毛細血管基底膜彌漫性增厚，足突融合，間質內大量膠原微纖維成束出現。DM組3個月和6個月組膠原含量均顯著高于對照組，表明早期即出現膠原的增生，且主要是Ⅲ型膠原在細胞間質的廣泛性、彌漫性表達并進行性增多，使DM大鼠腎臟僵硬度增加。因此，本研究提示在早期糖尿病中就出現腎小管間質的纖維化改變，且隨病程而加重。

綜上所述，DN的腎臟損害不僅局限于腎小球，而且常伴有腎小管間質的損害，并且部分患者腎小管受損還可能先于腎小球受損。通過對DM模型的病理分析，發現腎小管間質病變在DN的發生、發展中具有重要意義，其有助于早期判斷DN腎損害程度并改善其預后。

［1］Lea JP，Nicholas SB.Diabetes mellitus and hypertension:key risk factors for kidney disease［J］.J Natl Med Assoc，2002，94(8 suppl):7-15.

［2］紀立農，朱宇.糖尿病腎?。跩］.中國社區醫師，2003，19(23):11-12.

［3］Rastalidi WP，Ferrario F，Giardino L，et al.Epithelial mesenchymal transition of tubular epithelial cells in human renal biopsies［J］.Kidney Int，2002，6291):137-146.

［4］Taal MW Zandi-NejadK，Weening B，et al.Proinflammatory gene expression and maerophager ecmitment in the rat remnant kidney［J］.Kidney Int，2000，58(4):1664-1676.

［5］Najafian B，Kim Y，John T，et al.A tubular glomeruli and glomerulotubular Junction abnormalities in diabetic nephropathy［J］.J Am Soc Nephrol，2003，014(4):908-917.

［6］Bagby SP.Diabetic nephropathy and proximal tubule ROS:challenging our glomerulocentriaty ［J］.Kidney Int，2007，71(12):1199-1202.

［7］安娜，劉惠蘭，王英.2型糖尿病大鼠腎小管間質病變及TGF-β1、HCF和CTGF表達的變化及意義［J］.首都醫科大學學報，2008，29(3):315-320.

［8］朱雪婧，劉伏友，彭佑銘，等.糖尿病腎病病理分型最新國際標準的臨床應用(附37例回顧性分析)［J］.中南大學學報:醫學版，2012，37(2):185-189.

［9］Thomas MC，Burns WC，Cooper ME.Tubular changes in early diabetic nephtopathy ［J］.Adv Chronic Kidney Dis，2005，12:177-186.

［10］Liu Y.Epith elial to mesenchymal transition in renal fibogenesis:pathologic significance，molecular mechanism and therapeutic intervention ［J］.J Am Soc Nephrol，2004，15:1-12.

［11］van Kooten C，Daha MR，van ES LA.Tubular epithelial cells:a critical cell type in the regulation of renal inflammatory processes［J］.Exp Nephrol，1997，7:429-437.