臨床病理檢驗中不同骨組織脫鈣液效果的比較

李玉蓮，徐曉艷(內蒙古醫科大學病理學教研室，呼和浩特 00059;內蒙古醫科大學第一附屬醫院病理科;通訊作者，E-mail:xxy_patho@63.com)

含有骨質的腫瘤，鈣化組織及骨髓穿刺組織都很堅硬，要想制成幾微米的漂亮HE切片是很困難的。脫鈣液是決定骨骼、牙齒、病理性鈣化或骨化組織切片質量、染色效果的關鍵技術之一。目前使用的脫鈣液大多數是無機強酸類制劑，雖然脫鈣效果好，但造成組織形態，特別是細胞結構的破壞。因此，在本實驗中我們選擇了傳統的脫鈣液和快速脫鈣液兩種脫鈣液進行比較，進而尋找一種更適合于骨組織脫鈣的方法。研究中發現快速脫鈣液在不破壞組織結構及影響染色的同時，它可促進脫鈣并加快脫鈣速度，防止纖維性組織過度膨脹，并且保證了切片的質量，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

收集內蒙古醫科大學附屬醫院2009-2011年手術切除的骨腫瘤、病變骨及骨髓穿刺病人標本共40例。根據標本的不同將骨組織取成體積為1.5 cm×1.5 cm×0.5 cm的薄片(骨髓一般直徑均為0.1 cm)，放入10%中性福爾馬林固定24 h，用于脫鈣實驗。

1.2 普通脫鈣液及脫鈣方法與步驟

普通脫鈣液是5%的硝酸，即5 ml硝酸加入95 ml蒸餾水配制而成。具體脫鈣步驟:①先把大塊骨組織標本切成小段，小塊骨組織標本不用改刀，然后放入10%中性福爾馬林中固定24 h左右后再進行脫鈣。②將待脫鈣的標本放入5%硝酸脫鈣液中，脫鈣液不少于待脫鈣標本總體積的10倍。③室溫下進行脫鈣:骨髓穿刺標本需30-60 min，肋骨、指趾骨需3-6 d，皮質骨需要5-7 d。④脫鈣后的組織經流水沖洗后進行取材、脫水、透明、常規石蠟包埋、制片。

1.3 快速脫鈣液及脫鈣方法與步驟

快速脫鈣液是由36%-38%鹽酸8 ml、冰醋酸5 ml、水楊酸10 g、蒸餾水87 ml混合而成。用微波爐進行微波時，微波輻射可加速組織內部分子運動，加快脫鈣速度，因標本在酸性溶液中滯留的時間短，所以對組織的損傷小。具體脫鈣步驟:①先把大塊骨組織標本切成小段，小塊骨組織標本不用改刀，然后放入裝有快速脫鈣液的耐高溫塑料容器或玻璃容器內，容器要大并加蓋，脫鈣液不少于待脫鈣標本總體積的10倍。②再將容器放入最大功率為850 W的醫用微波爐中進行微波脫鈣。③入微波內加熱高檔(850 W)5 min達100℃，骨髓穿刺標本繼續留置10 min，其他標本繼續留置30 min為一個循環，檢查脫鈣效果。④脫鈣后的標本無需水洗，直接進行病理取材、脫水、透明，常規石蠟包埋、制片。

1.4 脫鈣時間

室溫下普通脫鈣液及微波條件下快速脫鈣液進行各種組織脫鈣所需時間有所不同，具體見表1。

表1 兩種脫鈣液具體脫鈣時間比較Table 1 Comparison of specific decalcification time between two kinds of decalcification solutions

2 結果

標本用快速脫鈣液處理后的效果要遠遠優于普通硝酸脫鈣，經此脫鈣液防止了纖維性組織過度膨脹，減少對骨組織結構完整性的破壞，制成的組織切片厚度一般為4-5 μm，不易脫片，并且切片平坦完整，薄厚均勻，HE染色新鮮，尤其細胞核染色清晰，著色鮮艷(圖1A、1B，見第1004頁)。而普通脫鈣液制成的組織切片，薄厚不均，切片不完整，HE染色模糊，尤其是核著色不清，影響病理診斷(圖1C、1D，見第1004頁)。

圖1 兩種脫鈣液對骨組織脫鈣后進行常規石蠟制片的效果觀察Figure 1 HE staining of bone tissue after bone decalcification by two kinds of decalcification solutions

3 討論

因骨組織、骨腫瘤含有大量的鈣鹽，鈣鹽只有遇酸溶解后組織變軟才能制作切片［1］。脫鈣是應用化學或物理的方法將骨組織成分中的鈣鹽及膠原纖維分離，棄去鈣鹽保留完整的膠原纖維成分［2］。

無論是任何一種脫鈣方法都是為了清除骨組織鈣鹽而使骨組織變軟進而進行制片［3］。但是不同脫鈣方法對骨組織制片影響不同，因此選擇優質、方便、快捷的脫鈣方法對骨組織方面疾病的病理診斷至關重要［4］。

傳統脫鈣方法是將標本取好直接放入5%硝酸溶液中進行脫鈣，一般需要1-10 d，然后再經固定脫水、包埋切片;切片厚度約在6-7 μm以上，并且切片時組織不完整，厚薄不均又易脫片，不僅損刀片，脫鈣時間也不好掌握［2］。因為酸在溶解鈣鹽的同時也溶解膠原纖維，雖然部分被溶解的鈣鹽與膠原纖維分離，但是還有部分鈣鹽與溶解的膠原混合存在，這樣妨礙了鈣鹽與膠原纖維的徹底分離，阻滯了酸由表及里地溶解鈣鹽的作用。結果 造成脫鈣時間延長、脫鈣不徹底或脫鈣后的組織不完整、進而破壞組織細胞形態結果及細胞成分的性質。最終造成細胞核不著色或著色很淺，從而影響對病變組織的病理診斷［5］。

而采用快速脫鈣液進行脫鈣一般需要10-40 min，不但將脫鈣時間縮短，同時保證了制片質量［4］。因為快速脫鈣液中的水楊酸具有松懈作用，能加速酸性溶液由表及里地溶解鈣鹽，被溶解的鈣鹽迅速發生沉淀，減少了與溶解膠原的混合，充分發揮水楊酸松解膠原作用;促進脂肪溶解，并且水楊酸還能破壞蛋白質的交聯，疏通組織間隙，有利于鈣鹽析出快速脫鈣［6］。因組織在酸性溶液里滯留時間短，對組織損害小，這樣切片較完整，染色效果極佳［7］。此種脫鈣方法簡單、便捷、快速，是有效的骨組織脫鈣方法，有利于保存骨組織結構和組織中的抗原物質，從而確保了臨床病理診斷［7］。

總之，我們認為快速脫鈣液要比普通脫鈣液在臨床診斷上更為適用。此種脫鈣液在不破壞組織結構及影響染色的同時，可促進脫鈣并加快脫鈣速度，防止纖維性組織過度膨脹，并且保證了良好的切片質量［6，8］。

［1］上海第一醫院病理解剖教研組.病理檢驗技術［M］.上海:上海科學技術出版，1978:189-243.

［2］孫青，張傳森.病理診斷與技術操作手冊［M］.山東:山東大學出版社，2002:36-37.

［3］曾嘉.甲酸體梯密度脫鈣法在透射電鏡樣品制備中應用［J］.天津醫科大學學報，2011，17(1):129+146.

［4］羅燦嶠，莫木群，鐘覺民.不同脫鈣液在骨組織制片中的比較應用［J］中國實用醫藥，2011，6(19):27-28.

［5］王伯云，李玉松，黃高升.病理學技術［M］.北京:人民衛生出版社，2009:943.

［6］曹穎.臨床病理檢驗常用骨組織脫鈣液效果比較［J］.第三軍醫大學學報，2009，31(23):2399-2400.

［7］黃勛福，韓福蘭，吳燕杏，等.甲酸脫鈣濃度對骨組織脫鈣后切片染色效果研究［J］.國際醫藥衛生導報，2009，15(13):60-62.

［8］王曉萌，丁洋，王曉梅，等.一種簡便快捷的骨及鈣化組織脫鈣液［J］.臨床與實驗病理學雜志，2011，27(5):554-555.