辛伐他汀對大鼠冠脈微栓塞后微小血管再生影響的實驗研究

曾 凱，王 永，陳美華，歐陽秋芳(福建中醫藥大學附屬福建省第二人民醫院心內科，福州 350003;福建中醫藥大學附屬福建省第二人民醫院超聲科;通訊作者，E-mail:fjzengkai@6.com)

冠脈微栓塞(coronary microembolization，CME)是臨床上十分常見的病理生理過程，嚴重地影響患者的心功能及預后。CME的本質是心肌微小血管栓塞及微循環灌注障礙［1］，故更有針對性的干預切入點應是恢復心肌組織的血流灌注。恢復血流灌注常用的方法主要有各種干細胞移植、各種生長因子干預及某些藥物刺激等。上述方法有別于外科搭橋手術及其他血管重建術，但其目標仍然是重建有效心肌血供，故被形象的稱為“誘導性心臟自身搭橋”或“治療性心肌血管再生”［2］。

動物試驗發現他汀類藥物具有促血管再生及改善心肌微循環的效應［3］。血管再生包括血管再生(angiogenesis)和血管發生(vasculogenesis)，他汀類對這兩個過程均有重要的影響［4］;他汀類改善心肌微循環障礙主要是繼發于甲烴戊酸通路的中間產物異戊烯類的生物合成減少，甲烴戊酸的合成減少可以使Akt(絲氨酸-蘇氨酸激酶)磷酸化而激活，從而使eNOs活性和穩定性增加，使心肌NO的水平升高［5］。基于此假設，本實驗擬建立一種穩定的大鼠CME模型，旨在探討辛伐他汀干預對CME后心肌微小血管保護與微小血管再生的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠40只，雌性，體重(300±20)g，由福建醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物及實驗步驟符合國家實驗動物管理條例。

1.2 實驗材料

辛伐他汀原藥粉(廣州南新公司)，NO試劑盒(南京建成生物醫學工程研究所)，Ⅷ因子相關抗原多克隆抗體，PE、TRITC標記的山羊抗大鼠的二抗(北京中山生物技術有限公司)，鹽酸氯胺酮(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司)。

1.3 實驗儀器

TKR-200C小動物呼吸機由江西省特力麻醉呼吸設備公司提供;多功能生理記錄儀BL-420E型由成都泰盟儀器廠提供，GE SYSTEMⅤ超聲心動圖儀及5-MHZ多平面經食道超聲探頭由美國GE公司提供;IMAGE PRO 4.0顯微鏡結合計算機顯微圖像分析系統由日本Olympus公司提供。

1.4 研究方法

1.4.1 CME模型建立 選用SPF級大鼠，從每只尾靜脈取血2 ml凝固成血栓，CS501-3C恒溫箱37℃過夜烘干，后取玻璃研磨器研磨，38 μm濾網濾過使之成為較均勻顆粒。電子天平稱重8 mg血栓顆粒供每只動物實驗備用。次日在大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉后，取仰臥位，術區備皮消毒，氣管插管，呼吸機輔助通氣。取第2肋間水平橫切口，剪斷胸骨，切開心包，暴露主動脈根部，取已稱好的血栓顆粒溶于0.5 ml生理鹽水中，用1 ml注射針桶吸取血栓懸浮液，使用直徑0.5 mm細針刺入心尖部，同時鉗夾升主動脈，10 s后松開鉗夾的升主動脈，壓迫穿刺口止血，關胸復蘇。為防止動物術后感染，每天肌注青霉素40萬U/只，連續3 d。

1.4.2 分組及干預方案 40只大鼠隨機分成5組:對照組(C組)、假手術組(sham組)、CME模型組(M組)、辛伐他汀干預組(ST組)及辛伐他汀加N-硝酸-L-精氨酸甲酯(L-NAME)干預組(STN組)，全部模型均制作成功，每組各8只動物。干預方案:ST組CME模型制備后，以辛伐他汀2 mg/kg/d，用生理鹽水稀釋到5 ml灌胃，每日一次。STN組:模型制備后，以辛伐他汀2 mg/(kg·d)加N-硝酸-L-精氨酸甲酯15 mg/(kg·d)用生理鹽水稀釋到5 ml灌胃，每日一次。M組:模型制備后，予生理鹽水灌胃，每日一次，一次5 ml。sham組:手術方法同M組，自心尖部注入生理鹽水替代血栓微粒，術后予生理鹽水灌胃，每日一次，一次5 ml。C組:未手術大鼠，予生理鹽水灌胃，每日一次，一次5 ml。所有動物均在飼養28 d處死。

1.4.3 主要指標檢測 采用Ⅷ因子染色評定單位面積心肌微小血管的密度，免疫熒光檢測單位面積心肌微小血管的數量，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定心肌組織勻漿NO含量。嚴格按照使用說明書進行操作。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 不同組別微小血管密度的變化

Ⅷ因子染色結果顯示，術后28 d，sham組與C組比較，微小血管密度差異無統計學意義(P＞0.05)。M組與sham組比較，微小血管密度明顯減少(P＜0.01)。ST組與M組比較，微小血管密度明顯增加(P＜0.01);STN組與ST組比較，微小血管密度顯著減少(P＜0.01，見表1)。C組及sham組心肌微小血管密度正常，M組心肌微小血管密度明顯降低，ST組辛伐他汀干預后心肌微小血管密度明顯多于M組，STN組L-NAME干預后心肌微小血管密度較ST組減少(圖1，見第160頁)。

表1 冠脈微栓塞后心肌內微小血管密度、微小血管數量、NO含量比較及辛伐他汀干預的影響(±s)Table 1 Density of micro-vessel，num ber of micro-vessel and level of NO in myocardium after coronary microembolization and the invention effect of simvastatin(±s)

表1 冠脈微栓塞后心肌內微小血管密度、微小血管數量、NO含量比較及辛伐他汀干預的影響(±s)Table 1 Density of micro-vessel，num ber of micro-vessel and level of NO in myocardium after coronary microembolization and the invention effect of simvastatin(±s)

與C組和sham比較，*P＜0.01;與 M組比較，#P＜0.01;與 ST組比較，ΔP ＜0.01

組別 n 微小血管密度/(/mm2)微小血管數量/(/mm2)NO含量/(mmol/kg)C組8 7.25 ±0.27 0 27.70 ±1.03 sham 組 8 7.32 ±0.19 0 27.75 ±1.28 M組 8 3.32 ±0.16*1.30 ±0.15* 20.87 ±2.23*ST 組 8 5.05 ±0.24#4.49 ±0.57# 26.37 ±1.30#STN 組 8 3.59 ±0.42Δ 3.28 ±0.22Δ 15.38 ±1.41Δ

2.2 不同組別微小血管數量的變化

免疫熒光結果顯示，ST組與M組比較，微小血管數量明顯增加(P＜0.01)，STN組與ST組比較，微小血管數量顯著減少(P＜0.01，見表1)。

與M組相比，ST組辛伐他汀干預后心肌新生微小血管明顯增多，STN組L-NAME干預后心肌新生微小血管較ST組減少(圖2，見第161頁)。

圖1 冠脈微栓塞后心肌內微小血管密度比較及辛伐他汀干預的影響(HE染色，bar=100 μm)Figure 1 Effect of simvastatin on density of micro-vessel in myocardium after coronary microembolization (HE，bar=100 μm)

圖2 冠脈微栓塞后心肌內微小血管數量比較及辛伐他汀干預的影響(免疫熒光染色×100)Figure 2 Effect of simvastatin on number of micro－vessel in myocardium after coronary microembolization(immunofluorescence，×100)

2.3 不同組別心肌組織勻漿NO含量的變化

術后28 d，sham組與C組比較NO含量差異無統計學意義(P＞0.05);M組與sham組比較，NO含量顯著下降(P＜0.05);ST組與M組比較，NO含量顯著增加(P＜0.01)。STN組與ST組比較，NO含量顯著下降(P ＜0.01，見表1)。

3 討論

引起CME的常見原因有斑塊自發破裂、經皮冠脈介入治療(PCI)術中機械損傷致斑塊破裂、溶栓術中血栓溶解不全等，CME嚴重時可引起患者猝死［1，2］。CME發生后慢性過程中心功能仍然持續性或進行性惡化［6］。因此，尋找CME后慢性過程中有效的干預措施顯然十分重要。

他汀類藥物是當前最強效的降低血清膽固醇或LDL-C的藥物，臨床廣泛應用于高膽固醇血癥的治療及冠心病的一級、二級預防。本實驗結果顯示，術后28 d，辛伐他汀組與模型組比較，心肌內微小血管密度和新生微小血管數量明顯增加。初步證實了CME后辛伐他汀干預可減少心肌微小血管的破壞并增加心肌微小血管及毛細血管的再生。大量研究表明，他汀類藥物可促進內皮細胞釋放NO，從而達到保護內皮細胞的作用。本研究也進一步證實，經辛伐他汀處理的動物其心肌組織中的NO含量明顯升高。NO與內皮細胞的遷移關系密切［7］，NO還可以促進內皮祖細胞表面整合素的表達，整合素可支持血管細胞建立的新血管，這在微血管再生中起到關鍵性的作用［8］;同時，NO也可以動員骨髓內皮祖細胞，增加循環EPCs數目，促進微血管的發生［9］。NO為血管內皮生長因子(VEGF)的下游效應器，有調節血管VEGF促血管內皮細胞增殖作用［10］。因此，他汀刺激NO的釋放可能就是通過上述機制發揮促進血管新生的作用。

L-NAME是NO的特異性阻斷劑之一，我們的研究結果證實，經L-NAME處理的動物，辛伐他汀對CME后新生血管生成的促進作用部分消失，進一步表明辛伐他汀可能是通過NO介導的信號通路來發揮促進血管新生作用的。

綜上所述，辛伐他汀可增加冠脈微栓塞后心肌內微小血管密度和新生微小血管數量，而這種作用可能是通過NO介導的。

［1］Su Q，Li L，Liu YC，et al.Effect of metoprolol on myocardial apoptosis and caspase-9 activation after coronary microembolization in rats［J］.Exp Clin Cardiol，2013，18(2):161-165.

［2］Chen Z，Qian J，Ma J，et al.Glucocorticoid ameliorates early cardiac dysfunction after coronary microembolization and suppresses TGF-β1/Smad3 and CTGF expression［J］.Int J Cardiol，2013，167(5):2278-2284.

［3］Asai J，Takenaka H，Hirakawa S，et al.Topical simvastatin accelerates wound healing in diabetes by enhancing angiogenesis and lymphangiogenesis［J］.Am J Pathol，2012，181(6):2217-2224.

［4］Shimada T，Takeshita Y，Murohara T，et al.Angiogenesis and vasculogenesis are impaired in the precocious-aging klotho mouse［J］.Circulation，2004，110(9):1148-1155.

［5］Scalia R，Gooszen ME，Joines SP，et al.Simvastatin exerts both anti-inflammatory and cardioprotective effect in apolipoprotein E-deficient mice［J］.Circulation，2001，103(21):2598-2603.

［6］Otto S，Seeber M，Fujita B，et al.Microembolization and myonecrosis during elective percutaneous coronary interventions in diabetic patients:an intracoronary Doppler ultrasound study with 2-year clinical follow-up［J］.Basic Res Cardiol，2012，107(5):289-294.

［7］Marcelo KL，Goldie LC，Hirschi KK.Regulation of endothelial cell differentiation and specification ［J］.Circ Res，2013，112(9):1272-1287.

［8］Vaiyapuri S，Hutchinson EG，Ali MS，et al.Rhinocetin，a venomderived integrin-specific antagonist inhibits collagen-induced platelet and endothelial cell functions［J］.J Biol Chem，2012，287(31):26235-26244.

［9］Mourino-Alvarez L，Calvo E，Moreu J，et al.Proteomic characterization of EPCs and CECs“in vivo”from acute coronary syndrome patients and control subjects［J］.Biochim Biophys Acta，2013，1830(4):3030-3053.

［10］Follin B，Tratwal J，Haack-S rensen M，et al.Identical effects of VEGF and serum-deprivation on phenotype and function of adipose-derived stromal cells from healthy donors and patients with ischemic heart disease［J］.J Transl Med，2013，11(1):219.