靜脈和吸入麻醉后認知功能障礙與BACE1基因多態性的關系

蔡英敏，張 勇，胡海濤，張蓬勃，李 蘭，舒粉寧(西安交通大學第二附屬醫院麻醉科，西安 710004;通訊作者，E-mail:roryzhang@126.com)

大量研究表明［1］，某些全麻藥能使誘發老年癡呆的物質Aβ生成加速;而老年癡呆和遺傳有著密切的關系，其中β分泌酶基因就是一個與老年癡呆密切相關的基因之一。臨床觀察發現，全麻后認知功能障礙如果沒有得到及時、有效的治療，會演變為長期認知功能障礙，進而導致老年癡呆的發生。因此我們假設:全麻后認知功能障礙與某些全麻藥有密切關系，且與遺傳有一定的相關性。為此，我們設計了這個病例控制性研究，旨在探索全麻后認知功能障礙與麻醉藥的種類及與患者自身某些遺傳因素方面的關系。

1 材料與方法

1.1 分組及納入標準

本研究為病例控制、區段隨機分組的臨床實驗，受試者為西安交通大學第二附屬醫院的外科手術患者(神經外科因手術本身會對患者認知功能造成影響，因此被排除在外)，無精神病史及家族史。(基因多態性的分析需要大量樣本，因此需要很長時間收集樣本，這種研究的結果無論是陽性還是陰性都很有意義。)從2005-2012年總共有ASAⅠ-Ⅱ級擇期無血緣關系老年手術患者1 000例，平均年齡(70.2±5.1)歲，接受全身麻醉并被列為受試對象。所有患者術前均由臨床神經科醫師根據Folstein簡易精神狀況檢查法(mini mental state examination MMSE)［2］進行智力檢測，以剔除有癡呆癥狀表現的患者。根據受試者進入臨床試驗的時序分為8個區段，再對每個區段隨機化分為靜脈麻醉組和吸入麻醉組兩組(各500例)。兩組病人年齡、體重、性別、民族、手術種類等基線數據無顯著性差異(P＞0.05，見表1)。本實驗中麻醉師實施麻醉，麻醉助手進行術后隨訪，患者本人及隨訪者不知分組情況。本研究經西安交大第二附屬醫院倫理委員會批準。所有患者術前均簽署麻醉知情同意書和麻醉、精神藥品使用知情同意書。

表1 靜脈麻醉組和吸入麻醉組患者的基線數據Table 1 Com parison of baseline data between intravenous anesthesia group and inhalation anesthesia group

1.2 麻醉方法

所有患者麻醉前30 min常規肌肉注射地西泮10 mg，阿托品0.5 mg，進入手術室后開放靜脈通路，連接三路輸液導管。

靜脈麻醉組患者:三根TCI泵導管分別用于輸注芬太尼、丙泊酚和肌松劑維庫溴銨。設定芬太尼的靶濃度為 5.12 ng/ml，丙泊酚的靶濃度為 3 μg/ml，分六步給藥:起始靶濃度為 1 μg/ml，每次濃度增加0.4 ng/ml，間隔150 s;維庫溴銨的靶濃度為2.0-2.5 μg/ml。給藥順序為先啟動芬太尼 TCI泵，15 min后啟動丙泊酚TCI泵，22 min后啟動維庫溴銨TCI泵。在此期間先給予面罩給氧監測血氧飽和度，當患者呼吸停止后，行加壓面罩給氧;當BIS值到達40-60，肌松TOF比值到達10%-20%時，進行氣管插管。氣管插管成功后，行橈動脈置管，監測有創動脈壓;行頸內靜脈置管術，用于監測中心靜脈壓和輸血補液(因為受試者為老年患者，有創動脈壓和頸內靜脈是基本的監測手段以確保安全)。術中全憑靜脈維持麻醉深度，根據生命體征、BIS、心率變異性(HRV)、肌松監測調節上述三種藥物的靶濃度。

吸入麻醉組患者:按2 mg/kg丙泊酚靜脈注射，速度為4 mg/s，待病人意識消失時靜脈注射維庫溴銨0.08 mg/kg，行加壓面罩給氧，當 BIS值、肌松TOF比值同靜脈麻醉組時進行氣管插管，術中吸入異氟醚維持麻醉，根據與靜脈麻醉組相同的監測參數調節異氟醚吸入濃度。術中按照晶體與膠體3∶1的比例補充復方氯化鈉與羥乙基淀粉。

1.3 認知功能評價

術前與術后3 d內相同時間點記錄MMSE評分，評價患者認知功能的變化。

1.4 SNPS 位點查詢

在NCBI網站查找BACE1和BACE2基因的SNPS位點。

1.5 基因組DNA的提取

所有患者于麻醉前采取血樣本3 ml于EDTA抗凝劑(1 mg/ml)中，放入超低溫冰箱備用。

按照說明書進行基因組DNA的提取、濃度測定和質量檢測［3］。

DNA的保存:基因組DNA溶于TE緩沖液，-20℃保存備用。

引物設計:BACE1基因引物:上游引物5’-TTA TGT TCC CAG GCT CTC CCT TG-3’，下游引物 5’-ACT CAC TCT CCT TCT GTG CCA CCA G-3’。

BACE2基因引物:上游引物5’-CAT AAA CCT CCA TCT ACC TGA CAT A-3’，下游引物5’-CAG CAT TAT TGT GGT GAT AGA G-3’。

3）當流量為40～60m3/h（標準狀態下）時，功率應采用大于70kW，而當流量為30m3/h（標準狀態下）時，功率應采用50～60kW，一般情況下盡量不采用40kW的功率。

PCR擴增反應體系:BACE1 12 μl(包括Mix 6 μl;primer各 1.0 μl;H2O 2.5 μl;樣本 2.0 μl);BACE2 11 μl(包括 Mix 6 μl;primer各 1.0 μl;H2O 2.5 μl;樣本 1.5 μl)。

反應條件:BACE1，95℃預變性5 min，94℃45 s、58 ℃45 s、72 ℃60 s 30 個循環，72 ℃延伸20 min。BACE2，95 ℃預變性5 min，94 ℃45 s、62 ℃30 s、72℃30 s 30個循環，然后72℃延伸10 min。

按說明書方法進行聚丙烯酰胺凝膠電泳［3］。

1.6 統計學分析

MMSE評分均數采用t檢驗，基因頻率采用基因計數法，基因型及基因頻率比較采用χ2檢驗。統計軟件為STATA4.0醫學統計軟件。

2 結果

2.1 兩組病人MMSE評分均數

靜脈麻醉組患者術前、術后MMSE評分均值均高于25，而吸入組患者術后3 d的MMSE評分較術前及靜脈組同時間的MMSE評分均明顯降低(P＜0.05，見表2)。

2.2 靜脈和吸入麻醉患者BACE1基因頻率分布的比較

由表3可見隨機分入靜脈麻醉組和吸入麻醉組病人的BACE1基因頻率分布無明顯差異。

表2 靜脈麻醉組和吸入麻醉組病人MMSE評分均數(±s)Table 2 The MMSE of patients in intravenous group and inhalation group(±s)

表2 靜脈麻醉組和吸入麻醉組病人MMSE評分均數(±s)Table 2 The MMSE of patients in intravenous group and inhalation group(±s)

與術前比較，*P ＜0.01;與靜脈麻醉組比較，#P ＜0.01

組別 術前 術后第1天 術后第2天 術后第3天靜脈麻醉組 27.34 ±1.24 25.75 ±2.21 26.89 ±1.67 26.89 ±2.01吸入麻醉組 27.67 ±1.12 16.69 ±3.61*# 19.21 ±2.06*# 21.48 ±3.06*#

表3 靜脈麻醉和吸入麻醉組患者BACE1基因的頻率分布 (%)Table 3 The frequency distribution of BACE1 genotypes in intravenous group and inhalation group (%)

2.3 吸入麻醉組中不同MMSE評分組患者BACE1基因頻率的分布

將500例吸入麻醉組患者按照MMSE評分分為MMSE＜25分組和MMSE＞25分組，由表4可知有320例MMSE＞25被分入吸入1組，180例MMSE＜25被分入吸入2組中。吸入2組中G/G基因型頻率最高，G/C型次之，C/C型最少。經檢驗，吸入2組G等位基因(Z=3.92，P＜0.05)和 G/G 基因型(Z=4.03，P＜0.05)均高于吸入1組。而吸入2組C等位基因和C/C基因型與吸入1組比較，差異無統計學意義。

2.4 靜脈組中不同MMSE評分組患者BACE1基因頻率的分布

表4 吸入麻醉組中不同MMSE評分組患者BACE1G基因及G/C基因型頻率的分布 (%)Table 4 Frequency distribution of BACE1 genotypes in different MMSE patients in inhalation group (%)

表5 靜脈麻醉組中不同MMSE評分組患者BACE1G基因及G/C基因型頻率的分布 (%)Table 5 Frequency distribution of BACE1 genotypes in different MMSE patients in introvenous group (%)

2.5 靜脈和吸入麻醉兩組病人BACE2基因頻率的分布

由表6可見隨機分入靜脈麻醉組和吸入麻醉組患者的BACE2的基因頻率分布無明顯差異。

表6 靜脈麻醉和吸入麻醉兩組患者BACE2T等位基因及T/C基因型頻率多態的頻率分布 (%)Table 6 Frequency distribution of BACE2 genotypes in inhalation group and intravenous group (%)

2.6 吸入組中不同MMSE評分組患者BACE2基因頻率的分布

由表7可見吸入1組(MMSE＞25)和吸入2組(MMSE＜25)不同患者BACE2等位基因及基因型頻率分布的差異沒有統計學意義。

2.7 靜脈組中不同MMSE評分組患者BACE2基因頻率的分布

由表8可見靜脈1組(MMSE＞25)和靜脈2組(MMSE＜25)兩組患者的BACE2等位基因及基因型頻率分布的差異沒有統計學意義。

表7 吸入麻醉組中不同MMSE評分組中患者BACE2T等位基因及T/C基因型頻率的分布 (%)Table 7 Frequency distribution of BACE2 genotypes in different MMSE patients in inhalation group (%)

表8 靜脈麻醉組中不同MMSE評分組患者BACE2T等位基因及T/C基因型頻率的分布 (%)Table 8 Frequency distribution of BACE2 genotypes in different MMSE patients in intravenous group (%)

3 討論

靜脈麻醉或吸入麻醉都是目前臨床上廣泛應用的麻醉方法，目前我們還是把大量的精力放在怎樣維持術中生命體征的平穩上，而對術后患者認知功能的恢復缺乏足夠的關注。

在臨床實踐中，我們注意到即使不存在已知的危險因素，仍有一部分患者出現了術后認知功能障礙。我們認為一定還有其他一些因素未被發現。

在因老年癡呆而死亡患者的大腦病理切片中發現的淀粉樣蛋白沉積是診斷此病典型的病理特征，在形成淀粉樣蛋白的通路上，β-淀粉酶是一個關鍵酶［5］。已有研究表明BACE1的多態性與ApoEε4型老年癡呆顯著相關，但在不同國家、不同種族人群的研究結果不盡相同［6］。

由于全身麻醉后出現認知功能障礙的老年患者越來越多，我們假設攜帶BACE基因的患者較其他人更易出現神經生理功能的紊亂。基于這個假設，我們設計了一個病例控制性研究。在實驗中，患有嚴重的心、肺疾病或肝、腎功能不全的患者被排除于實驗之外，患有癡呆的老年病人也被排除。剔除這部分病例的原因是:如果將他們納入實驗組，我們將無法判斷術后認知功能障礙是疾病本身引起的，還是全身麻醉誘發的，在統計學中，它應被視為一種混雜因素而剔除。實驗中兩組患者的基本條件沒有統計學差異。

麻醉藥引起的腦代謝紊亂被認為是誘發術后認知功能障礙的一個基本機制［7］。為了確保患者的安全，研究中使用的麻醉藥物應該是在臨床中應用廣泛或有較長的應用歷史。在本實驗中進行比較的兩種麻醉劑:吸入麻醉劑異氟醚和靜脈麻醉劑丙泊酚是世界范圍內應用最為廣泛的兩種麻醉劑，因此被選為實驗藥品。

本研究首次揭示了在接受吸入麻醉或靜脈麻醉的老年患者中出現的術后認知功能障礙和BACE1 G/G基因型的關系。我們測量了兩組患者BACE1和BACE2的基因型。通過對兩組病人BACE1和BACE2基因頻率分布的分析，首先排除了隨機分入兩組的患者基因頻率分布的差異性。結果 顯示隨機分入兩組病人的BACE1和BACE2的基因頻率分布無明顯差異。通過分析吸入麻醉組中不同MMSE評分組患者BACE1基因頻率的分布，提示G/G基因型與吸入麻醉術后MMSE的降低的關系應該受到關注。

我們研究發現隨機分配入靜脈麻醉組和吸入麻醉組的兩組患者中，BACE1 G基因型和等位基因頻率無明顯差異，而術后出現認知功能障礙的患者數量差異明顯。在靜脈麻醉組中，出現認知功能障礙的患者數量少，MMSE評分均在20-25分之間，無永久性認知功能障礙的患者。這些患者與本組評分在25分以上的患者之間基因型和等位基因頻率無明顯差異。說明全憑靜脈麻醉對老年人長期的認知功能沒有明顯影響，MMSE評分的高低與BACE1單核苷酸多態性無明顯相關性。在吸入麻醉組中，認知功能障礙患者的數量與靜脈組有明顯差異，在不同評分組的患者中BACE1基因型和基因頻率出現差異，在MMSE評分較低一組中BACE1 G等位基因和G/G基因型頻率出現較多，在BACE1 G等位基因與氣體麻醉組中MMSE評分的關聯性分析中，提示BACE1 G等位基因可能是老年患者接受氣體麻醉后出現認知功能障礙的一個危險因素。

本研究中吸入麻醉組患者的認知功能障礙主要出現在術后3 d，提示這兩種麻醉方法都沒有導致長期的認知功能障礙。但是在吸入麻醉組中，尤其是攜帶BACE1 G等位基因的患者出現術后短期認知功能障礙的機會要大于靜脈麻醉組。雖然這種短期的認知功能障礙短期內得以恢復，我們也不能就因此認為在患者腦內的某些區域沒有任何形態學或生理、生化方面的改變。一項新近的研究發現［8］:將大鼠暴露于濃度低于2%的異氟醚中僅2 h，就能增加腦內Aβ的含量。因此我們認為吸入性麻醉藥對人腦有一種潛在的危害，至少對攜帶某些基因的老年患者如此。至于這種危害是否長期存在于腦內，需要進一步的研究加以證實。

在本研究中靜脈麻醉、吸入麻醉兩組中BACE1基因多態性成隨機分布，差異沒有顯著性意義，在靜脈麻醉組中不同評分的兩組BACE1基因的多態性的差異也沒有統計學意義;但在吸入麻醉組中，評分低的一組與BACE1基因G/G基因型和G等位基因關聯顯著，因此我們有理由把BACE1的多態性看成可能是誘發老年性癡呆的一個危險因素。

BACE2為 BACE1的同源物［9］。518個氨基酸組成BACE2［10］，結構和 BACE1類似，亦含有 N端的信號序列、前蛋白質區、成熟蛋白催化區和C端延伸區。BACE2在109-112和300-303處含有2個天冬氨酸蛋白酶活性區域，2個N-糖基化位點和6個半胱氨酸殘基，這些殘基的位置與BACE1很接近，具有和BACE1極為相似的三級結構［10］。近年來，研究證實淀粉樣β淀粉樣分泌酶BACE1和BACE2為兩種具有β2分泌酶活性的天冬氨酸蛋白酶［11］，它們均可在體外發生 APP的 β 酶解作用。21q22.3區域是編碼BACE2蛋白基因所在區域，而這個區域內可能存在遲發性AD的易感基因。研究BACE2基因與AD發病風險關系的結果未能證實BACE2基因多態在AD發病風險中的作用，只是在個案報道中發現與家族性老年癡呆相關的BACE2基因的多態性。我們研究的結果顯示:不論靜脈麻醉組還是吸入麻醉組，在不同MMSE評分的人群中，BACE2基因的多態性沒有顯著性差異。說明這個基因多態性與散發的老年性認知功能障礙無相關性。這個結果從另一方面支持它可能是與家族性老年癡呆相關的基因。

本研究主要觀察靜脈麻醉和吸入性麻醉兩種不同的麻醉方式以及BACE1及BACE2基因多態性與術后認知功能障礙發生的關系。在本研究中靜脈麻醉的代表藥物是丙泊酚，吸入麻醉的代表藥物是異氟醚。但是，臨床上應用的靜脈和吸入麻醉藥物還有很多種，在一項研究中無法一一列舉。老年人術后認知功能障礙的發生與其他麻醉藥物的應用有什么樣的關系，需要進一步深入研究。

基因多態性受地域、種族等因素影響較大，本研究對象主要是西北地區的漢族人群，因此研究結果有它的局限性。如果能有不同民族、不同地域的多中心研究，結果將更具有普遍意義。

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