柚寄生多糖的提取與含量的測定

廖彭瑩，邱志彬，卓生華

（廣西中醫藥大學，廣西南寧530001）

柚寄生，別名柚樹寄生、緣柚寄生等，為桑寄生科槲寄生屬植物瘤果槲寄生（Viscum ovalifolium DC.）的帶葉莖枝[1]。它可寄生于柚樹、黃皮、柿樹等多種植物上，主要分布于華南及云南等地[1]。柚寄生是黎族和苗族常用藥材，以帶短段寄主的全株入藥，鮮用或曬干使用[2]，味苦、辛，性涼，功能主治為祛風除濕、活血止痛、化痰止咳、解毒[1]。對柚寄生的研究表明，其化學成分類型主要有三萜類、甾醇類、皂苷類、黃酮類，前人已從中分離到羽扇豆醇乙酸酯、羽扇豆醇硬脂酸酯、羽扇豆醇棕櫚酸酯、β-香樹脂醇、齊墩果酸、常春藤皂苷元、絲石竹酸等小極性成分，還分離到一些極性較大的皂苷類成分，包括常春藤皂苷元-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷、常春藤皂苷元-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖基-（2→1）-β-D-吡喃葡萄糖苷、3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖基-常春藤皂苷元-28-O-β-D-吡喃葡萄糖基-（1→6）-β-D-吡喃葡萄糖苷[3-4]。有學者測定了柚寄生的總皂苷含量[5]、總蛋白質含量[6]及總黃酮含量[7]，結果表明其總皂苷、總蛋白質及總黃酮的含量均較高。本文作者也對柚寄生的總黃酮組分進行了提取工藝和體外活性的初步研究，優選出了總黃酮的較優提取工藝，證明柚寄生的總黃酮組分對人肝癌細胞Hep3B有一定的體外抑制作用[8]。柚寄生的多糖組分鮮有相關報道，多糖是自然界一類重要的生物大分子，是維持生命機體正常運轉的基本物質之一，具有多種藥理特性，包括免疫調節、抗腫瘤、降血糖、抗氧化、抗疲勞、清除自由基、抗衰老、降血脂、抗菌、抗病毒功能[9]。柚寄生含有多糖組分[10]，為進一步深入開發柚寄生藥材的利用價值，本研究采用水提醇沉法對柚寄生多糖進行了提取，并對其進行了脫蛋白、脫色等處理，采用紅外光譜法對柚寄生多糖的結構進行了初步分析，以葡萄糖為對照品，采用蒽酮-硫酸法測定了柚寄生的多糖含量，為減小誤差，采用精制柚寄生多糖測定了柚寄生多糖對葡萄糖的換算因子[11]。

1 材料與儀器

1.1 材料

柚寄生2009年購于廣西玉林藥材市場，由廣西中醫藥大學韋松基教授鑒定為寄生于柚樹的桑寄生科槲寄生屬植物瘤果槲寄生（Viscum ovalifolium DC.）的干燥帶葉莖枝。藥材于60℃烘干至恒重后粉碎，過60目篩。葡萄糖、95%乙醇、濃硫酸、蒽酮、氯仿、正丁醇、石油醚、丙酮、乙醚、無水乙醇均為國產分析純。

1.2 儀器

電子天平：北京賽多利斯儀器系統有限公司；Agilent 8453型可見-紫外分光光度計：美國安捷倫科技有限公司；NEXUS 470型（FT-IR）傅立葉紅外分光光度計：美國尼高力儀器公司。

2 實驗方法

2.1 多糖的提取精制

提取精制工藝參照文獻[11-14]設計，稱取藥材粉末約50 g，加入石油醚500 mL回流提取3次，每次2 h，過濾。藥渣揮干，再加入80%乙醇500 mL回流提取3次，每次2 h，過濾。藥渣揮干，加入 1000 mL蒸餾水煎煮3次，每次1 h。過濾得到水提取液，合并濃縮至約50 mL，得粗多糖溶液。將粗多糖溶液轉入分液漏斗中，采用Sevag法除蛋白，加入相當于其1/4體積的氯仿-正丁醇混合溶液（預先配制，體積比為4∶1混合液），充分振搖，取水層，重復以上操作，直至下層無明顯乳白色沉淀出現為止。所得水層即為脫去蛋白的多糖溶液，向其中加入活性炭，置于水浴鍋中攪拌10 min，抽濾，再向濾液中加入乙醇至其濃度為80%，靜置過夜，抽濾，將所得沉淀用丙酮、乙醚、無水乙醇分別進行洗滌，沉淀自然揮干，得到灰色精制多糖0.699 g，置于干燥器中備用。

2.2 多糖的化學檢識

用斐林試劑反應和Molish反應對精制多糖進行化學檢識，觀察反應的顏色變化。

2.3 多糖的紅外光譜分析

將所得精制多糖約1 mg與KBr固體粉末在瑪瑙研缽中研磨均勻，制成薄片，用紅外分光光度計在400 cm-1～ 4000 cm-1波數范圍進行掃描，觀察出現的紅外吸收峰。

2.4 溶液的配制

葡萄糖標準溶液的配制：精密稱取葡萄糖對照品0. 0408 g，加蒸餾水溶解，定容于200 mL容量瓶中，配成0.204 mg/mL的葡萄糖標準溶液。

蒽酮-硫酸溶液的配制：精密稱取0. 2002 g蒽酮，加入100 mL濃硫酸，混合搖勻，定容于100 mL棕色容量瓶中，置暗處保存。（現配現用）

樣品溶液的制備：精密稱取藥材粉末1 g，加入80%乙醇20 mL回流提取3次，每次1 h，過濾。藥渣揮干，加入60 mL蒸餾水于90℃保溫提取2次，每次1 h，過濾，用熱蒸餾水反復洗藥渣并與過濾所得水提取液合并至200 mL容量瓶中，定容，得樣品溶液。

2.5 標準曲線的繪制

精密吸取 5、10、15、20、25、30 mL 葡萄糖標準溶液分別置于50 mL容量瓶中，以蒸餾水定容，搖勻，得系列對照品溶液。精密吸取系列對照品溶液各1 mL，置于10 mL具塞試管中，均加入蒽酮-硫酸溶液4 mL，搖勻，冷卻，于沸水浴中加熱10 min，再于冰水浴中冷卻至室溫，放置20 min，在626 nm下測定吸光度，另精密吸取1 mL蒸餾水，同法操作，作為空白參比。以吸光度（A）為縱坐標，以系列對照品溶液濃度（C）為橫坐標，繪制標準曲線。

2.6 換算因子的測定

精密稱取精制多糖100 mg，置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解，定容，搖勻，得精制多糖水溶液，從中精密吸取10 mL，置于50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻，備用（平行制備3份）。精密吸取此液1 mL置于10 mL具塞試管中，按照2.5項下方法測定吸光度，由標準曲線計算溶液中葡萄糖濃度，按下式求出換算因子：f=W/CD，式中：W為稱取多糖的重量，mg；C為葡萄糖濃度，（mg/mL）；D為稀釋倍數。

2.7 多糖含量的測定

按照2.4項下方法制備樣品溶液，平行制備3份，各精密吸取1 mL置于10 mL具塞試管中，按照2.5項下方法測定吸光度，由標準曲線折算樣品溶液中葡萄糖濃度，按下式計算多糖含量，多糖含量（%）=CDf/W×100，式中：C 為樣品溶液中葡萄糖濃度，（mg/mL），D 為稀釋倍數；f為換算因子；W為樣品重量，mg。

2.8 精密度實驗

精密吸取1 mL樣品溶液置于10 mL具塞試管中，按照2.5項下方法測定吸光度，重復取樣測定5次。

2.9 穩定性實驗

精密吸取樣品溶液1 mL置于10 mL具塞試管中，按照2.5項下方法測定吸光度，之后每隔20 min測定一次吸光度，考察樣品溶液在2 h內的穩定性。

2.10 重現性實驗

精密稱取5份藥材粉末各1 g，按照2.4項下方法制備樣品溶液，精密量取樣品溶液1 mL置于10 mL具塞試管中，按照2.5項下方法測定吸光度，計算多糖含量。

2.11 加樣回收率實驗

精密吸取5份已知多糖含量的樣品溶液30 mL置于50 mL容量瓶中，分別加入葡萄糖對照品溶液10 mL，用蒸餾水定容，搖勻，再從中精密吸取1 mL置于10 mL具塞試管中，按照2.5項下方法測定吸光度，計算回收率及RSD值。

3 結果與討論

3.1 多糖的化學檢識

精制多糖與斐林試劑反應，現象為生成棕紅色沉淀；與Molish試劑反應，現象為放熱、生成紫紅色環。以上現象說明待測樣品含有糖類組分。

3.2 多糖的紅外光譜分析

多糖的紅外光譜分析見圖1。

圖1 柚寄生多糖的紅外光譜圖Fig.1 The IR spectrum of the polysaccharides from Viscum ovalifolium DC.

從紅外光譜圖中可觀察到如下峰： 3413 cm-1出現寬峰，應為多糖-OH的伸縮振動峰，2937 cm-1應為-CH伸縮振動吸收峰，1658 cm-1可能為糖的烯醇式異構引起的吸收峰，1607 cm-1可能為碳碳雙鍵伸縮振動吸收峰，1022 cm-1為C-O伸縮振動吸收峰。由紅外譜圖可觀察到多糖的部分官能團吸收峰，但也有部分非多糖物質引起的紅外吸收峰。

3.3 標準曲線的繪制

以吸光度（A）為縱坐標，以系列對照品溶液濃度（C）為橫坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程A=5. 7545C+0. 0105，相關系數r=0. 9995，線性范圍0. 0204 mg/mL～0. 1224 mg/mL。

葡萄糖的標準曲線見圖2。

3.4 換算因子的測定

精制多糖的換算因子計算見表1。

由此可得換算因子f=2.276。

3.5 多糖含量的測定

樣品溶液的多糖含量計算見表2。

圖2 葡萄糖的標準曲線Fig.2 The standard curve of the glucose solution

表1 換算因子的計算結果Table 1 The result of the correct factor

表2 樣品溶液的多糖含量Table 2 Determination of the polysaccharides from the sample

測得柚寄生多糖平均含量為3.55%，RSD為2.55%。

3.6 方法學考察結果

樣品溶液的精密度、穩定性、重現性、加樣回收率考察分見表 3、4、5、6。

表3 樣品溶液的精密度測定結果Table 3 Result of precision experiment

表4 樣品溶液的穩定性測定結果Table 4 Result of stability experiment

表5 樣品溶液的重現性測定結果Table 5 Result of repeatability experiment

表6 加樣回收率測定結果Table 6 Result of recovery experiment

表3～表6列出了該含量測定方法的方法學考察結果，從中可以看出，該方法的精密度良好，在2 h內穩定，測定結果重現性良好，加樣回收率結果良好。

4 結論

通過水提醇沉法提取了柚寄生多糖，以葡萄糖為對照品，采用蒽酮-硫酸法測定了柚寄生多糖含量，測得其平均含量為3.55%，該含量測定方法的精密度、穩定性、重現性、加樣回收率的考察結果均良好，說明該測定方法可靠，可用于柚寄生多糖的含量測定。多糖組成復雜，用葡萄糖標準曲線來折算多糖含量會引起誤差，本實驗利用精制柚寄生多糖計算柚寄生多糖與葡萄糖的換算因子，以避免這種誤差。蒽酮-硫酸加入到樣品溶液中會放出熱量，在操作時每份樣品的冷卻時間、加熱時間要嚴格一致，這樣才能保證所得結果的準確性。

柚寄生含有類型豐富的化學成分，多糖是其中重要一類，多糖的生物活性多樣，有著重要的開發價值。相信通過進一步對柚寄生多糖的生理活性展開研究，能夠深入挖掘柚寄生藥材的利用價值。

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