鄰苯二甲醛法(OPA)與高效液相色譜法(HPLC)測定降膽固醇的雙歧桿菌的對比

張汝嬌，何臘平，3，李翠芹，張玲，王猛，朱秋勁

1(貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽，550025)2(貴州省農畜產品貯藏與加工重點實驗室，貴州 貴陽，550025)

3(貴州省豬肉制品工程技術研究中心，貴州貴陽，550025)4(貴州大學化學與化工學院，貴州 貴陽，550025)

WHO曾預測，心腦血管疾病到2030年仍是引起死亡的主要原因［1］。而血清中膽固醇過高是引發冠心病、動脈硬化、腦中風等心腦血管疾病的重要因素［2］。因此，降低血清中膽固醇的含量則成為目前心血管疾病科學研究工作的熱點之一。目前，運用生物轉化法，特別是運用益生菌對膽固醇進行直接降解已成為研究的趨勢。

雙歧桿菌是一種具有降低膽固醇作用的腸道益生菌［3］，但不同菌株間降膽固醇作用差異較大，所以一般需先建立體外篩選降膽固醇的模型，然后進行雙歧桿菌菌株降膽固醇能力的初步篩選。Bordoni［4］曾發現1株兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)能在體外吸附膽固醇達到81 mg/g。陳路清［5］等研究也發現青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)體外能降低膽固醇在50%左右。

由于膽固醇是不溶于水的物質，體外篩選能降膽固醇的雙歧桿菌通常是制備含有膽固醇膠束的培養基，加入菌體培養后測其膽固醇的值進行判斷。目前常用于測定膽固醇的方法有化學法，包括硫酸鐵銨法［6］、鄰苯二甲醛(OPA)法［7］;色譜法，包括高效液相色譜(HPLC)［8］、氣相色譜(GC)［9］;色質聯用法，包括氣質聯用(GC-MS)和液質聯用(LC-MS/MS)［10-11］;以及運用分子印跡聚合物為填料的固相萃取技術的物理法［12］等等。化學法簡單易操作，色譜及質譜法則對實驗儀器配置要求高，酶法對測定膽固醇特異性強，主要用于血清中膽固醇的檢測，而分子印跡技術尚在探索中條件不成熟。但考慮前期大量體外篩選菌株的情況，本實驗選擇了常用的化學法OPA法與色譜法HPLC法對實驗所保藏的5株雙歧桿菌菌株進行降膽固醇實驗，通過比較這2種方法來選擇最宜的體外篩選的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

香豬源性雙歧桿菌，由實驗室提供。

表1 菌株名稱Table 1 The name of stains

1.1.2 主要設備及儀器

YQX-II厭氧培養箱，上海新苗醫療器械制造有限公司;SW-CJ-10超凈工作臺，蘇州凈化有限公司;CX21SF1奧林巴斯生物顯微鏡，奧林巴斯中國有限公司;TU—1810PC紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司;1260安捷倫高效液相色譜，安捷倫科技有限公司;08-2G磁力攪拌加熱冷凝回流裝置，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司;RE-52AA旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.1.3 培養基及主要試劑

培養基:PTYG 培養基［13］，降膽固醇培養基CHOL-PTYG:參考陳路清［5］的方法進行改良:在普通PTYG液體培養基中，加入膽固醇膠束溶解液使膽固醇濃度為0.1 mg/mL。1 000 mL液體培養基中含0.l mg/mL膽固醇膠束溶液的制備:準確稱量膽固醇(分析純)0.1 g放入小燒杯中加入0.2 g牛膽鹽、1 mL TWEEN-80、0.1 g蔗糖八乙酸酯，攪拌均勻，再移取5 mL的冰乙酸加熱溶解，把溶解液用超聲波處理15 min后，過0.45 μm濾膜后快速加入到配制好的液體培養基中，邊加入邊攪拌，使其形成均勻穩定的膠體溶液。以上均121℃滅菌20 min后備用。

主要試劑:膽固醇(≥99%)，色譜純，Sigma公司(C8667-1G);膽固醇(≥99%)，分析純，上海藍季科技發展有限公司;鄰苯二甲醛 ，化學純，國藥集團化學試劑有限公司;蔗糖八乙酸酯 ，化學純，國藥集團化學試劑有限公司。

膽固醇儲備液(1 mg/mL):精確稱取0.05 g(精確至0.01 mg)膽固醇(色譜純)，用10 mL無水乙醇完全溶解后定溶至50 mL，即得1 mg/mL的膽固醇母液，于4℃冰箱放置過夜。

OPA試劑(0.5 mg/mL):精確稱取0.05 g鄰苯二甲醛，用20 mL冰乙酸完全溶解后定溶至100 mL，即得0.5 mg/mL的鄰苯二甲醛溶液，避光保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 鄰苯二甲醛法(OPA)［14］

1.2.1.1 OPA法標準曲線繪制

準確吸取膽固醇儲備液各 0.2、0.5、1.0、1.2、1.5、2.0 mL，用無水乙醇定容至10 mL。配置分別相當于 0.02、0.05、0.10、0.12、0.15、0.20 mg/mL 質量濃度的標準溶液。在各管中加入OPA試劑總體積達到4 mL，室溫放置10 min。再向其中緩慢加入4 mL濃硫酸，立即用振蕩器振20 s，充分混勻后于室溫條件下放置10 min?？瞻讓φ找? mL無水乙醇代替膽固醇儲備液，最后測其在550 nm處的吸光度值，以膽固醇濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標做標準曲線，并計算線性回歸方程。

1.2.1.2 總膽固醇提取

取待測液1 mL放于清潔試管中，每管加入6 mL的95%乙醇 ，混勻后每管加入4 mL的500 g/mL KOH溶液。然后加蓋置于60℃水浴鍋中水浴30 min進行皂化，每隔10 min振搖1次使皂化完全，皂化完畢取出試管冷卻后加入10 mL正己烷，用振蕩器振1 min，使之充分混合，再加入6 mL蒸餾水，混勻。在室溫放置20 min，靜置分層，小心吸取8 mL正己烷層(上層)轉移到清潔試管中小心放置于60℃水浴鍋中，氮氣吹干。

1.2.1.3 總膽固醇測定

于蒸干后的試管中加入4 mL當天配置的OPA試劑，室溫放置10 min。再向其中緩慢加入4 mL濃硫酸，立即用振蕩器振20 s，充分混勻后于室溫條件下放置10 min。最后測其在550nm處的吸光度(A550)，以空白實驗校零，查標準曲線，結果用mg/mL表示。

1.2.2 高效液相色譜法［15］

1.2.2.1 樣品測定前處理

(1)皂化。加入20 mL的降膽固醇培養基上清液，于250 mL平底燒瓶中，用10 mL無水乙醇分3次沖洗三角錐形瓶，洗液并入平底燒瓶。再加入20 mL無水乙醇，10 mL 60%KOH溶液，混勻。將試樣在100℃磁力攪拌加熱皂化回流1 h，皂化結束，用10 mL無水乙醇自冷凝管頂端沖洗其內部和溫度感應器，取下平底燒瓶，冷卻至室溫。

(2)提取.向冷卻皂化液中加入5 mL蒸餾水，用漏斗全部轉移與250 mL分液漏斗中，用30 mL蒸餾水，分3次沖洗平底燒瓶和漏斗，洗液并入分液漏斗，再用40 mL正己烷分3次沖洗平底燒瓶和漏斗，洗液并入分液漏斗，振搖2 min，靜置分層。轉移水相于第二個分液漏斗，再用30 mL正己烷重復提取兩次，棄去水相，合并3次有機相。分別用10mL正己烷用蒸餾水每次100 mL洗滌提取液至中性(5次)，提取液通過約10 g無水Na2SO4脫水，全部轉移至250 mL平底燒瓶中，用20 mL正己烷分2次沖洗分液漏斗，一并倒入平底燒瓶。

(3)濃縮。將上述平底燒瓶中的提取液在旋轉蒸發儀上，40～45℃蒸發至近干，用無水乙醇溶解定容至10 mL，超聲溶解，然后過0.45μm過濾膜，過濾液待HPLC檢測。

1.2.2.2 高效液相色譜法測定色譜條件

色譜柱:SinoChrom ODS-BP 4.6 mm×150 mm 5 μm;柱溫:35℃;流動相:甲醇;流速:1 mL/min;波長205 nm;進樣量 10 μL。

1.2.2.3 HPLC標準曲線繪制

準確吸取膽固醇儲備液各 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，用無水乙醇定容至 10 mL。配置分別相當于0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL 質量濃度標準溶液。然后進行HPLC測定。以濃度為橫坐標，峰面積(響應值)為縱坐標繪制標準曲線，并計算線性回歸方程。

1.2.3 精密度試驗

取同一空白CHOL-PTYG培養基溶液按方法1.2.1和1.2.2中的測定條件重復平行測定5次，計算相對標準偏差，并分析其重現性。

1.2.4 加標回收率試驗

取同一空白CHOL-PTYG培養基溶液按方法1.2.1和1.2.2中的測定條件重復平行測定3次，分別計算其膽固醇的濃度。另取CHOL-PTYG培養基溶液加入一定量的膽固醇標準溶液，按照方法方法1.2.1和1.2.2分別計算兩種方法的加標回收率。

1.2.5 雙歧桿菌降膽固醇率的測定

將表1中的5株菌株進行活化，在PTYG培養基上純化培養3次后，接種到液體PYTG培養基中富集培養。將待測菌液值調至OD 0.4按10%(V/V)接種量接種于膽固醇含量為0.1 mg/mL的CHOLPTYG 中厭氧培養(N2∶CO2∶H2=90∶5∶5)37 ℃中培養48 h。菌液以10 000 r/min，4℃條件下離心20 min，保留上層清液作為待測液用于測定膽固醇含量，以未接種的PTYG-CHOL作為對照。降膽固醇率S計算:

式中:S，降膽固醇率;B，未接種的PTYG-CHOL培養基中膽固醇濃度，mg/mL;A，待測發酵上清液中膽固醇質量濃度，mg/mL。

1.2.6 數據分析

所有數據運用OriginPro 8.0與SPSS Statistics 17進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 OPA法膽固醇標準曲線的繪制

按方法1.2.2.1繪制的OPA法膽固醇標準曲線見圖1。膽固醇在0～0.20 mg/mL的質量濃度范圍內呈現良好的線性關系，其回歸方程為y=4.9264x-0.0130，相關系數R2為0.999 2。

2.2 HPLC法膽固醇標準曲線的建立

圖1 膽固醇標品的OPA標準曲線圖Fig.1 Standard curve of cholesterol measured by OPA

從圖2可以看出，在1.2.3.2色譜條件下，膽固醇能夠很好地達到分離效果，其保留時間t(膽固醇)=6.852 min。經多次重復實驗和實際樣品分析顯示，保留時間在±0.1 s范圍內均代表同一物質。

圖2 膽固醇標品的HPLC分離圖Fig.2 Chromatogram of standard solution of cholesterol

按方法1.2.3.3繪制的HPLC法膽固醇標曲曲線見圖3，由圖3可以表明膽固醇濃度在0～0.70 mg/mL的質量濃度范圍內呈現良好的線性關系，膽固醇標準曲線為y=5 050.238 1x+32.166 7相關系數R2=0.999 7。

圖3 膽固醇標品的HPLC標準曲線圖Fig.3 Standard curve of cholesterol measured by HPLC

2.3 精密度試驗

同一空白CHOL-PTYG培養基，相同條件下用OPA法重復測定吸光度5次，計算所得吸光度平均值0.493，相對平均偏差RSD%=0.32%(n=5)，表明OPA法重現性良好，儀器精密度良好。相同條件下用HPLC法重復進樣5次，計算所得峰面積平均值1 074，相對平均偏差 RSD%=0.96%(n=5)，表明HPLC法重現性良好，高效液相色譜精密度良好。

2.4 加標回收率試驗

經計算得到CHOL-PTYG培養基的膽固醇含量為0.103 mg/mL，加入質量濃度為0.1 mg/mL的膽固醇標準溶液。經OPA方法測定其平均加標回收率為100.18%，相對平均偏差RSD=0.30%(n=3)，說明OPA方法準確可信。經HPLC方法測定其平均加標回收率為99.33%，相對平均偏差RSD=0.30%(n=3)。

2.5 實驗菌株OPA與HPLC方法比較結果

將表2得到的數據進行t檢驗，得到t=0.437，查對t值表得出，OPA法與HPLC方法兩種方法的測定結果差異不顯著(P=0.669＞0.05)。5株菌株的降膽固醇率在12.34%～28.57%不等。

表2 5株雙歧桿菌菌株的降膽固醇率結果Table 2 The result of degradation rate of cholestrol of five strains in vitro

3 討論與結論

實驗結果表明，鄰苯二甲醛法與高效液相色譜法檢測膽固醇含量這兩種方法，其精密度相當，重復性好，所測得的加標回收率表明兩種方法準確可信。而且5株菌株經過降膽固醇實驗說明OPA法與HPLC方法兩種方法的測定結果差異不顯著(P=0.669＞0.05)，也即化學法OPA法與色譜法HPLC法均可用于降膽固醇雙歧桿菌的初篩檢測。郭翔［16］同樣通過OPA法與HPLC法測定卵磷脂-膽固醇膠束溶液中的膽固醇含量發現兩種方法其差異不顯著。

國標GB/T5009.128《食品中膽固醇的測定》［6］中的同樣采用化學方法，但其試用范圍僅為各類動物性食品中的膽固醇的測定，在測定時預先采用索氏脂肪提取法提取油脂后，再以硫酸鐵銨作為顯色劑，測定油脂中的膽固醇含量。而OPA是一種經典的方法，所需的實驗儀器及試劑條件更易獲取，不需要流動相，測試環節中的成本相對較低，也無需在測定膽固醇實驗之前，先提取脂肪，縮短了試驗進程。本實驗的高效液相方法是在國標GB/T22220-2008《食品中膽固醇的測定》［15］基礎上修改了提取步驟的試劑，用正己烷代替了石油醚和乙醚，發現提取效果良好，避免了由于乙醚揮發性大而造成的溶劑損失。筆者在實驗過程中發現，OPA法相對于HPLC法而言，具有檢測迅速，可在2 h內完成的特點，且在待測液膽固醇的提取步驟中更為簡便。而HPLC法在皂化提取步驟中較繁瑣，更容易因為人為操作不當，造成人為誤差。有報道可以通過不進行皂化處理而直接用石油醚、氯仿、甲醇萃?。?7-18］或者是通氮氣加快皂化處理［19］等方法測定膽固醇，效果良好，所以后期也將繼續對本試驗中方法進行改良，在篩選的后期階段采用高效液相方法來驗證OPA法的結果。所以，目前對于降膽固醇雙歧桿菌的前期大量的篩選環節，建議使用OPA法進行對雙歧桿菌降膽固醇能力的測定。

另外本次試驗的5株雙歧桿菌菌株的降膽固醇率在12.34% ～28.57%之間，降膽固醇能力不高。而香衛欽［20］等從成年人的糞便中分離出1株雙歧桿菌，膽固醇去除率能達到34.6%，尹軍霞［25］等從東北虎的腸道篩選到1株兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)體外降膽固醇能力達到57.14%，后期還需繼續對高降膽固醇的雙歧桿菌進行篩選或者對現有雙歧桿菌進行誘變，以便得到1株高降膽固醇率的雙歧桿菌。

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