生物轉化合成β-苯乙醇代謝途徑及其調控的研究*

杜閃，王雪花，楊政茂，劉笑生，宋煥祿，王鳳寰，王肇悅

1(北京工商大學分子感官科學實驗室，北京，100048)

2(北京工商大學食品學院，北京，100048)3(中國科學院微生物研究所，北京，100101)

β-苯乙醇(β-Phenylethanol)是一種芳香族伯醇，常溫下是無色液體，具有淡雅、細膩而持久的玫瑰花香［1］，具有抑菌性能，可作為多種香型的底香組分，在食品、日化用品和煙草等中添加，對其他的香氣成分有增效作用，且對護膚品有保質作用［2］。

β-苯乙醇的生產方法有3種:生物資源提取法、化學合成法及微生物轉化法［3］。微生物轉化法為“天然”產品，雖然成本高，但安全、口感好、味道自然，受到消費者青睞。歐洲立法規定，如果對終產品要標稱“天然”，則也要求作為前體的原料必須是“天然”的。通過艾氏途徑生產β-苯乙醇，以L-苯丙氨酸為惟一氮源時，β-苯乙醇的產量有顯著提高。市場上的L-苯丙氨酸基本采用微生物發酵法或酶法生產，無疑是屬于天然產品的，而且市場價格便宜，可以滿足大規模的生物轉化法生產β-苯乙醇的需求。

1 合成β-苯乙醇的微生物

許多發酵食品中均含有 β-苯乙醇，如可可、咖啡、面包、果汁、啤酒、奶酪以及醬油等［3］。事實上，許多酵母菌具有從頭合成和生物轉化L-苯丙氨酸生成β-苯乙醇的能力，例如馬克斯克魯維酵母、乳酸克魯維酵母、釀酒酵母、異常漢遜酵母等。不少真菌如猴頭菌、黑曲霉等也具有從頭合成或轉化L-苯丙氨酸為β-苯乙醇的能力，但相對而言，其合成或轉化能力較差。目前已報道的用于轉化L-苯丙氨酸生成β-苯乙醇的較多的菌種是釀酒酵母、馬克斯克魯維酵母、中國克魯維酵母3種［4］。

2 合成β-苯乙醇的代謝途徑

2.1 苯丙酮酸途徑

在一些酵母中，β-苯乙醇可通過合成芳香族氨基酸的莽草酸途徑從頭合成［3，5］。代謝途徑見圖1。

圖 1 L-苯丙氨酸代謝途徑［3，5］Fig.1 L-phenylalanine(L-Phe)metabolism［3，5］

由糖酵解過程中產生的磷酸烯醇式丙酮酸，與磷酸戊糖途徑中產生的4-磷酸赤蘚糖在2-酮-3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶(DAHP合酶)作用下通過中間體DAHP形成莽草酸，再經中間體分支酸和預苯酸在分支酸變位酶和預苯酸脫水酶的作用下形成苯丙酮酸，苯丙酮酸一方面可通過苯乙醛生成β-苯乙醇;另一方面，也可通過與L-谷氨酸的轉氨作用形成L-Phe。代謝途徑中DAHP合酶及預苯酸脫水酶受到L-Phe的反饋抑制。這條途徑廣泛存在于微生物體內，但是代謝途徑太長，支路太多，并存在著多種抑制作用，所以最終得到的β-苯乙醇產量很低。

2.2 艾氏途徑

生物轉化合成β-苯乙醇的另一條途徑是L-苯丙氨酸通過氨基酸的轉氨作用生成苯丙酮酸，再脫羧形成苯乙醛，苯乙醛經氧化脫氫酶作用生成β-苯乙醇，代謝途徑見圖2。這個途徑首先是由Ehrlich發現，后來便以他的名字命名［4，6-7］。其中 2-含氧酸的脫羧作用是艾氏途徑中雜醇形成的關鍵步驟［8］。還有一條途徑為L-苯丙氨酸去羧基生成苯乙胺，苯乙胺通過去氨基作用生成苯乙醛，苯乙醛再經過還原作用生成苯乙醇，但通常情況下這個途徑很少發生。

圖2 艾氏途徑轉化L-苯丙氨酸生成苯乙醇［9］Fig.2 β-phenyl ethanol produced by Ehrlich pathway transformation L-phenylalanine［9］

在微生物細胞中，β-苯乙醇合成走哪一條途徑取決于培養基中的氮源［10］。谷氨酸、銨鹽等一般作為優質的、較易利用的氮源使用，而氨基酸、尿素等只作為次級氮源使用。但是，只有當L-苯丙氨酸作為唯一氮源時，艾氏途徑才占優勢。如果環境中有其他更容易利用的氮源存在，即使在較高的L-苯丙氨酸濃度條件下，L-苯丙氨酸仍有一部分通過其它途徑被代謝［10］。如通過肉桂酸途徑(如圖1)降解為3-酮基乙二酸進入TCA循環，而且這個降解途徑不能完全被抑制，所以任何條件下，L-苯丙氨酸不可能完全轉化為 β-苯乙醇［5］。

3 艾氏途徑中相關酶及其編碼基因的研究

作為利用微生物合成β-苯乙醇的首選途徑，艾氏途徑在近幾年里已在基因水平上得到了廣泛而深入的研究，研究的重點在于編碼艾氏途徑3個步驟中3種酶的結構基因及其轉錄和調控，如圖3所示［11］。這3種酶分別是轉氨酶、脫羧酶和醇脫氫酶。第一步反應的轉氨酶與菌體的生理生長密切相關，通過與α-酮戊二酸之間的轉氨作用與TCA循環緊密聯系。但是目前吸引絕大多數研究者注意的是第二步反應中苯丙酮酸脫羧酶的基因本質，它是艾氏途徑中的關鍵酶［5］。

3.1 轉氨酶編碼基因及其調控

圖3 艾氏途徑(支鏈氨基酸(亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)和含硫氨基酸(甲硫氨酸)的代謝導致雜醇和雜酸的形成。該圖指出了編碼艾氏途徑每一步反應所需酶的基因［11］)Fig.3 The Ehrlich pathway

艾氏途徑中的第一步反應是轉氨酶催化進行的。Kradolfe利用DEAE層析分離得到參與第一步的轉氨作用的兩個酶:一個是芳香族轉氨酶I(ARO8)，在酵母中是組成型表達，能夠催化與苯丙氨酸相關的絕大部分轉氨反應，它在細胞內普遍存在，是主要的芳香族轉氨酶［12］;另一個是芳香族轉氨酶II(ARO9)，是誘導表達蛋白［13］。

3.1.1 芳香族轉氨酶I(ARO8)

當菌體在含有芳香族氨基酸的條件下生長時，需要有芳香族轉氨酶I催化進行。該酶與酪氨酸和苯丙氨酸的親和力是色氨酸的20倍［14］。缺失aro8的突變菌株不能在這些氨基酸是唯一氮源的條件下生長，這一事實并不適用于所有條件中的第一步轉氨基反應:(1)所有條件下都不能生長;(2)必須含有芳香族氨基酸(類似于尿素培養基中加入誘導物)［14-15］。

3.1.2 芳香族轉氨酶II(ARO9)

芳香族轉氨酶II是分解代謝中的一個誘導酶，且在生長時合成代謝中通常不表達。但是，在aro8基因缺失的突變株中可以催化苯丙氨酸和酪氨酸的生物合成［14］。

芳香族轉氨酶II的編碼基因為ARO9基因，有以下特性:(1)培養基內的酪氨酸、苯丙氨酸或色氨酸可以誘導ARO9基因的轉錄，當缺失這些誘導物時，其轉錄水平很低;(2)芳香族轉氨酶II催化這些氨基酸分解代謝的第一步反應;(3)該酶在以苯丙氨酸或酪氨酸為唯一氮源的條件下不是必須的，但是aro9突變體在色氨酸或犬尿酸為唯一氮源的條件下生長緩慢;(4)初期表達研究表明，當誘導物存在的情況下，氨效應抑制ARO9的表達;(5)芳香族氨基酸誘導ARO9基因表達需要一個36bp的元件UASaro以及反式作用元件ARO80p，UASaro是Aro80p的DNA結合部位［16］。結合部位在ARO9及ARO10基因的啟動子中，含有特殊的 WRCCGWSATTTRCCG 基序［11］。

3.1.3 其他轉氨酶

Twt1p(又稱為Bat1p或Eca39p)是線粒體支鏈氨基酸轉氨酶，而Twt2p(Bat2p or Eca40p)是細胞質內的同工酶。當分批培養時，線粒體內的同工酶在對數期大量表達，但是在穩定期時受到抑制;細胞質內的同工酶則相反［11］。

3.2 苯丙酮酸脫羧酶編碼基因及其調控

釀酒酵母基因組中含有5個可能編碼苯丙酮酸脫羧酶活性的基因，包括3個丙酮酸脫羧酶基因PDC1、PDC5、PDC6，以及另外兩個認為有編碼以焦磷酸硫胺素為輔酶的脫羧酶活性的可讀框ARO10/YDR380w、THI3/YDL080c［17-18］。報道中釀酒酵母中丙酮酸脫羧酶Pdc1和Pdc5、Pdc6的編碼基因PDC1、PDC5和PDC6以及相關的THI3和ARO10基因可影響雜醇及雜酸的產生［19-21］。

3.2.1 丙酮酸脫羧酶PDC

丙酮酸脫羧酶(Pyruvate decarboxylase，PDC)是釀酒酵母代謝途徑中的關鍵調節酶，其活性直接影響釀酒酵母發酵產物［22］，屬于二磷酸硫胺素(thiamine diphosphate，ThDP)依賴性非氧化酶［23-24］。

PDC1和PDC5在多數培養條件下編碼主要的丙酮酸脫羧酶［19，25-26］。在酵母細胞中，PDC5 的表達量低于PDC1的表達量的10%。然而，當PDC1缺失時，會強烈刺激PDC5的啟動子活性，激發PDC5的表達;當PDC1開放閱讀框缺失時，同樣激發PDC5啟動子的活性。這種現象成為“自身調節”［27］。除了自身調節之外，PDC1和PDC5的表達還受到碳源、硫胺素以及可能的其他營養的信號和生長期的控制。(1)葡萄糖可以使PDC1的表達量提高3～10倍，實際的誘導程度因不同菌種而異;在PDC1缺失的情況下，PDC5的表達量大約提高50倍，使得PDC5成為糖酵解相關基因中碳源效應最強的基因。當葡萄糖濃度很高時，Pdc參與的反應會進一步增強。目前碳源效應的機制尚不明確［27］。(2)硫胺素強烈抑制PDC5的表達，而不是PDC1。在硫胺素存在的情況下，PDC5的表達量遠遠低于PDC1，其啟動子活性幾乎檢測不到;當沒有硫胺素時，PDC1啟動子活性比硫胺素存在時略低［28］，但PDC5的表達量與PDC1缺失的菌株在有硫胺素時的表達量是相當的［27］，有很大的提高。(3)此外，PDC1和PDC5的表達還需要轉錄 因 子 Pdc2p［8，27，29］。在 pdc2 缺 失 的 條 件 下，PDC1的表達量下降至原來的10%，而對于PDC5而言，即使在 PDC1缺失的突變株中，也完全不表達［27］;(4)PDC5 的表達還取決于 THI3 基因［11］。

PDC6僅僅在含硫低的條件下表達，并編碼一種含硫氨基酸較少的丙酮酸脫羧酶［8，19，30-32］。

在分批培養的條件下，無論是葡萄糖為唯一碳源，或者是再添加乙醇或醋酸鹽的基本培養基中，pdc缺失的釀酒酵母不能在含有葡萄糖的條件下生長［33］。

3.2.2 THI3

THI3(ORF YDL080c)編碼一個與丙酮酸脫羧酶(Pdc)十分相似的蛋白質。THI和PDC1、PDC5基因的 高 水 平 表 達 需 要 調 控 蛋 白 Pdc2p［27，29，34］。YDL080c可以催化含支鏈2-含氧酸的脫羧，并調控硫胺素代謝中的相關基因［21］。但是，Thi3在硫胺素合成中的作用是調節作用，不是催化作用［8，11］。當僅有THI3基因時，不能檢測出的α-酮酸脫羧酶活性［11］，不能催化苯丙酮酸或者丙酮酸脫羧［21］。另一方面，Pdc1、Pdc5、Pdc6及 Aro10存在于細胞質中，而Thi3不僅存在于細胞質中，還存在于細胞核中，這更加證實了其調節作用［11］。

3.2.3 苯丙酮酸脫羧酶ARO10

ARO10基因的上游調節序列與ARO9基因非常相似，也具有36 bp的上游激活序列，受Aro80p誘導調控［16］。兩者的誘導表達還受制于一種銨鹽效應，生長在次級氮源條件下的細胞加入銨鹽時，誘導作用受阻。此外，ARO10受色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸以及甲硫氨酸等的誘導作用可提高其轉錄或表達水平［19］。通過多表達ARO10基因，證明該基因受碳源和氮源的轉錄后調控;或者Aro10p的催化活性和/或穩定性需要至少一個蛋白的存在，這種蛋白的表達依賴于碳源和氮源［19］。

Vuralhan等證明苯丙酮酸脫羧酶活性主要由ARO10基因決定的［21］。在不同氮源的條件下，5個基因中只有ARO10基因的轉錄水平有較大改變［19］。當分別超表達 pdc1、pdc5、pdc6、aro10 及thi3 時，只有Pdc1，Pdc5和Pdc6催化細胞提取物中的直鏈2-氧-丙酮酸、2-氧-丁酸甲酯和 2-氧-戊酸［8］，僅有 Aro10 和Pdc5可以催化芳香族底物苯丙酮酸的脫羧，而Aro10表現出較好的動力學特征。Aro10、Pdc1、Pdc5以及Pdc6在所有支鏈及含硫2-含氧酸測試中顯示出活性。Aro10的高親和力說明它是形成含支鏈及含硫的雜醇油的關鍵因素［8］。

不依賴于ARO10的苯丙酮酸脫羧酶活性需要有TDL080c和至少一個 PDC 基因同時存在［20，35］。

3.3 醇脫氫酶編碼基因及其調控

艾氏途徑的最后一步是雜醇醛還原或氧化分別形成雜醇或雜酸［36］。對于β-苯乙醇而言，是經過還原反應形成。在雜醇形成過程中必須經由幾個氧化還原酶來催化，包括:乙醇脫氫酶［20，36，37］、甲醛脫氫酶 Sfa1p［20］、3-甲基丁醛還原酶［36，38］、阿爾多酮還原酶 Ypr1p［36，39］以 及 至 少 一 個 假 定 的 芳 醇 脫 氫 酶(AAD6)［18，36］。

釀酒酵母編碼乙醇脫氫酶基因主要有五個:ADH1、ADH2、ADH3、ADH4、ADH5，其中乙醇脫氫酶Adh1p、Adh3p、Adh4p和Adh5p在發酵過程中執行還原乙醛生成乙醇功能，而乙醇脫氫酶Adh2p則行使催化乙醇生成乙醛的生物學功能［40，41］。Adh1p，Adh2p和Adh3p都需要鋅［20］。艾氏途徑中的最后一步(形成雜醇)可以被Adh1p～Adh5p中的任何一個或者 Sfa1p(甲醛脫氫酶)催化［11，20］。

3.3.1 乙醇脫氫酶Ⅰ(ADH1)

在糖酵解生成醇的過程中Adh1p是主要的細胞質酶［20］，并在乙醇發酵中起主要作用［42］。ADH1 基因缺陷型釀酒酵母在厭氧或者存在呼吸抑制劑的條件下生長緩慢［43］。ADH1基因的過表達可以增強釀酒酵母的甲醛抗性［44］。

3.3.2 乙醇脫氫酶Ⅱ(ADH2)

盡管ADH1和ADH2有89%的序列相似性，但其底物親和力不同，Adh2p對乙醇有高度親和力，主要負責醇的降解［42］。Adh2p也是細胞質酶，但是受到葡萄糖的抑制，需要在醇中生長［20］。缺乏adh2活性的菌株不能在以乙醇為唯一碳源的培養基上生長。adh2缺陷型菌株在發酵時可以積累大量甘油［45］。

3.3.3 乙醇脫氫酶Ⅲ(ADH3)

ADH3主要編碼線粒體基質中的乙醇脫氫酶同功酶［20］。乙醇脫氫酶ADH3具有催化乙醇分解的生物學功能，可降低酵母細胞乙醇產率［41］。Adh3p受葡萄糖的誘導［20］，環境中葡萄糖的存在抑制ADH3的表達，但其抑制程度較 ADH2低［43］。Adh3p的缺失破壞了線粒體的氧化還原代謝平衡環境［42］。adh3基因缺陷菌株在好氧條件下的生長速度與野生型菌株相比，基本沒有變化［46］。但是在厭氧條件下，adh3基因缺陷菌株生長明顯比野生型緩慢［42］。

3.3.4 乙醇脫氫酶Ⅳ(ADH4)

該基因在大多數實驗菌株中其表達量很低，但在發酵菌株中卻很高［20］。鋅離子可以維持Adh4p蛋白活性，并且在沒有鋅的環境中能誘導該基因的轉錄［47］。與此同時，ADH4基因的表達可以受到鋰離子的增強和DMSO(二甲基亞礬)的抑制［48］。

3.3.5 乙醇脫氫酶Ⅴ(ADH5)

乙醇脫氫酶Ⅴ(ADH5)是在基因組序列中發現的，目前它的功能尚不清楚［20］。

3.3.6 甲醛脫氫酶(SFA1)

Sfa1p(sensitive to Form AldehydeⅠ)，是一個雙功能酶，具有降解長鏈醇類和谷胱甘肽依賴型甲醛脫氫酶雙重功能［20］。Sfa1p的表達受到許多化學因素，例如甲醛、乙醇和甲磺酸甲酯等的影響［49］。當該酶氧化甲醛或丙酮醛時需要GSH和NAD，但是當氧化長鏈醇時卻不需要GSH，并且其活性隨鏈的長度而改變［49］。當SFA基因缺失時，菌株對甲醛的新陳代謝活性會降低［49］。

4 展望

β-苯乙醇應用非常廣泛。近年來，由于人們對于天然產物的需求，加之生物轉化法有成本低、無污染、周期短等優勢，通過生物轉化合成β-苯乙醇越來越受到人們的關注。目前，我們仍需深入研究β-苯乙醇代謝過程中關鍵酶及其編碼基因的調控方式，通過改良菌株的遺傳背景，并優化其發酵條件，進一步提高β-苯乙醇的產量。

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