溶劑體系下Lipozyme RM IM催化卵磷脂乙醇解及其他醇對乙醇解的影響*

馬嬌娜，楊國龍，楊若茜，畢艷蘭，孫尚德

(河南工業大學 糧油食品學院，河南 鄭 州，450001)

溶血磷脂與天然磷脂相比不僅保留了磷脂的親水和親油基團，還能減少非極性基團而明顯增加其親水性能、改善了磷脂因HLB值偏低而導致的應用范圍受限的情況，更適合用作O/W型乳化劑，已經廣泛應用于食品、醫藥、化妝品、飼料加工等領域［1-3］。

脂肪酶催化大豆卵磷脂改性制備溶血卵磷脂的方法包括水解法和醇解法。其中，脂肪酶水解卵磷脂會產生過多的脂肪酸，且不利于酶和產品的回收。國內對脂肪酶醇解的應用一般集中于油脂醇解制備生物柴油，而對催化磷脂醇解方面的報道較少，因此有必要對其做深入研究。另有報道表明，脂肪酶在不同醇中的反應活性不同，且不同醇的組合會對酯交換反應產生不同作用［4］。因此，本研究選用脂肪酶(Lipozyme RM IM)催化卵磷脂乙醇解，并研究其他醇對卵磷脂乙醇解反應的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

大豆卵磷脂(PC)，沈陽天峰生物工程技術有限公司;Lipozyme RM IM，諾維信公司贈送;十七酸甲酯標準樣品，購自Sigma公司;三氯甲烷、甲醇及甲酯化用正己烷，色譜純;溶劑用正己烷、無水乙醇、正丁醇、叔丁醇、1，2-丙二醇、丙三醇等試劑均為分析純，使用前經分子篩脫水處理。

MK-6S棒狀薄層色譜分析儀，日本三菱公司;Agilent 6890N型氣相色譜儀，美國 Agilent公司;BSA224S電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司(Max 220 g，d=0．1 mg);DF-101Z 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市京華儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1．2．1 卵磷脂的脂肪酸組成分析

卵磷脂的甲酯化方法采用三氟化硼甲酯化法［5］。氣相色譜檢測條件為:Agilent 6890N型氣相色譜儀;氫火焰離子化檢測器(FID);毛細管柱，BPX-70(30．0 m × 250 μm × 0．25 μm，澳大利亞 SGE 公司);進樣口溫度，210℃;柱溫，180℃;檢測器溫度，300℃。

卵磷脂的相對分子質量計算公式:

式中:MPC，卵磷脂的分子質量;MFA，脂肪酸的平均分子質量;M甘油，甘油的分子質量;M磷酸，磷酸的分子質量;M膽堿，膽堿的分子質量;MH2O，水的分子質量;Mi，脂肪酸的分子質量;ni，脂肪酸的摩爾百分含量。

1．2．2 Lipozyme RM IM催化卵磷脂醇解制備溶血卵磷脂

稱取一定量卵磷脂溶于正己烷中，根據卵磷脂與醇中羥基的摩爾比加入一定量乙醇，再向體系中加入微量水，恒溫下攪拌20 min后，加入適量脂肪酶，醇解反應開始，定時取樣進行檢測分析?？疾旆磻獪囟?、加酶量(以 PC質量計)、溶劑比(PC∶正己烷，g∶mL)、底物比(PC∶醇中羥基，mol∶mol)、加水量(PC∶水，g∶uL)對LPC轉化率的影響，確定PC乙醇解的適宜條件，進一步研究X醇(正丁醇、叔丁醇、1，2-丙二醇和丙三醇)對乙醇解的影響。

1．2．3 原料卵磷脂及其醇解產物的組成分析

采用棒狀薄層色譜/氫火焰離子化檢測器(TLC/FID)分析原料卵磷脂及其醇解產物中卵磷脂(PC)、溶血卵磷脂(LPC)、甘油磷脂酰膽堿(GPC)及其他物質的相對含量。將卵磷脂及其醇解產物溶解于三氯甲烷中，配制成濃度為10～20 mg/mL的溶液，取1 μL溶液點于薄層色譜棒上，在溶劑體系下展開后在90℃紅外烘箱中干燥5 min，然后進行檢測分析。展開液:V(CHCl3)∶V(CH3OH)∶V(H2O)=42∶22∶2．5。檢測條件:氫氣流速，100 mL/min;空氣流速，1．5 L/min;掃描速度，30 s/棒。

2 結果與討論

2.1 原料大豆卵磷脂

利用TLC/FID對大豆卵磷脂PC含量進行檢測，結果如圖1所示。圖1中卵磷脂峰面積明顯大于其他物質的峰面積，原料中PC含量為97．2%，純度較高，符合實驗要求。

圖1 大豆卵磷脂TLC/FID圖譜Fig．1 TLC/FID chromatograph of soy phosphatidylcholine

大豆卵磷脂經三氟化硼甲酯化后，其脂肪酸組成利用氣相色譜進行檢測，結果見表1。由公式1和公式2計算可知，大豆卵磷脂中脂肪酸的平均分子量為277．5，卵磷脂分子量為 794．0。

表1 大豆卵磷脂主要脂肪酸組成Table 1 Major fatty acid composition of soy phosphatidylcholine

2.2 溶劑體系中Lipozyme RM IM催化卵磷脂乙醇解

以有機溶劑為介質進行酶催化反應具有如下優點:提高脂溶性底物的溶解度;易于酶的回收和再利用;易于產物的分離純化;酶在有機溶劑中的熱穩定性比水中高［6］。有機溶劑中酶的穩定性增強是因為非水體系中沒有充足的導致某些酶失活的水分子［7］。極性強的有機溶劑可能因奪取酶維持其構象的必需水而對酶的催化活力不利［8］。本實驗選擇非極性的正己烷作為溶劑，研究該體系下醇的相互作用對Lipozyme RM IM催化卵磷脂乙醇解的影響。

2．2．1 溫度對乙醇解反應的影響

溫度是影響酶催化活性和反應速率的重要因素(如圖2所示)。

圖2 溫度對反應過程中LPC轉化率的影響Fig．2 Effect of temperature on LPC conversion during reaction

當反應溫度為40℃時，醇解反應速率明顯高于30℃，LPC轉化率達到平衡時所用時間較短，反應16 h后LPC轉化率即可達93%。這是由于反應溫度較低時，酶活力較低，隨著反應溫度的升高，酶活力逐漸增強直到最佳催化活力，同時反應體系粘度降低，傳質阻力減小，促進了醇解反應的進行。但過高的反應溫度則會使酶變性失活。此結果與Demirkol等［9］及Elizabeth［10］研究一致，Lipozyme RM IM 等脂肪酶在30～50℃活性較高。本反應中溫度為50℃時，隨著反應體系擴散系數的提高，初期反應速率較高，但反應10 h后LPC轉化率驟降。結合圖3可知，溫度過高不僅會影響酶的催化活性，還會導致副產物的生成。隨著反應的進行，LPC發生醇解反應，GPC含量急劇升高，最終導致LPC轉化率的顯著降低。從增大產物得率和縮短反應時間考慮，以40℃為最佳反應溫度。王渝鷺等［11］研究了無溶劑體系中Lipozyme RM IM催化卵磷脂制備溶血卵磷脂，確定了乙醇解的最適溫度為30℃，溶劑體系下最適溫度40℃與其相比有所升高，這是因為酶在有機溶劑中的熱穩定性增強，且無溶劑體系中短碳鏈醇對酶的毒害作用較大［12］。

圖3 溫度對反應過程中GPC含量的影響Fig．3 Effect of temperature on GPC content during reaction

2．2．2 加水量對乙醇解反應的影響

有機溶劑中，微量水是維持酶活性所必需的因素［13］。圖4 為加水量(PC:水，g∶μL)對 PC 乙醇解的影響。

圖4 加水量對反應過程中LPC轉化率的影響Fig．4 Effect of water amount on LPC conversion during reaction

加水量為1∶80 g∶μL時，醇解反應速率和 LPC轉化率都高于1∶60 g∶μL，說明加水量過低時，酶無法有效發揮其催化活力。由于水分影響酶蛋白的結構完整性、活性位點的極性與穩定性，加入適量水可維持酶的三維構象結構使其處于最佳催化活性狀態［14］。但過量的水則會抑制酶的活性，甚至促進副反應的發生［15］。當加水量為 1∶100(g∶μL)時，反應速率和產品最終得率都明顯低于其他2個考察水平，是因為水分添加量過大，水分子在酶活性位點之間形成水束，產生的介電屏蔽作用掩蓋了活性位點的極性，進而降低了酶的催化活性［14］。Selmi等［16］發現當酶中含水量足夠多時，加水后效果反而不好。

2．2．3 加酶量對乙醇解反應的影響

如圖5所示，加酶量為10%時，反應24 h尚未達到平衡且LPC轉化率僅為82%，而加酶量為15%和20%時，反應皆于16 h達到平衡，LPC轉化率分別為92%、95%。酶促反應主要是酶的活性基團與底物作用的結果，隨著加酶量的增加，活性基團增加，酶與底物的接觸機率增大，從而使得反應速率得到提高。Bernardes等［17］研究Lipozyme RM IM催化大豆油醇解制生物柴油時發現當加酶量為20%時酯產量明顯高于7%時的產量。本實驗也證實了Oliveira等［18］的報道，加酶對酯生產有積極作用。使用較多加酶量有助于避免酯交換量過低，因酶隨時間的延長而逐漸失活［19］。加酶量繼續增加，在一定面積的反應界面上，酶濃度最終達到飽和，反應趨于平衡［20］。加酶量15%和20%對催化醇解反應的結果差別不大，從節約成本方面考慮，選擇15%為最適加酶量。

圖5 加酶量對反應過程中LPC轉化率的影響Fig．5 Effect of enzyme load on LPC conversion during reaction

2．2．4 底物比對乙醇解反應的影響

底物比影響醇解反應速率并決定反應的平衡點。當底物比為1∶2(mol∶mol)時，反應速率和LPC轉化率較1∶3(mol∶mol)時都明顯低(圖 6)，這是由于較低底物比條件下乙醇的濃度較低，與卵磷脂碰撞機率小，底物結合少導致反應速率低。隨著底物比的增大，卵磷脂與乙醇的結合機率增大，促進醇解反應的進行。當底物比為1∶4(mol∶mol)時，反應達到平衡的時間及產品得率較1∶3(mol∶mol)時無明顯差異，主要原因是底物摩爾比為1∶3(mol∶mol)時，底物達到飽和，酶分子都能有效的與底物相結合，進一步增加底物比也很難提高產品中LPC的含量。另外，Ber-nardes等［17］研究大豆油醇解制生物柴油時發現，當醇/油摩爾比為10∶1時乙酯產量明顯比摩爾比為6∶1低，因為蛋白質在含有短碳鏈醇(如甲醇、乙醇)的反應體系中不穩定，溶劑體系下過量乙醇會促進脂肪酶的抑制或失活。Hass等［21］研究脂肪酶催化大豆甘三脂和卵磷脂醇解合成脂肪酸乙酯時發現，對于兩種底物，酶活通常隨乙醇濃度的增加而降低。Oliveira等［22］也報道了過量乙醇對酶促反應有抑制作用。

從縮短反應時間和提高產品得率方面考慮，結合成本因素，1∶3(PC:醇中羥基，mol∶mol)為最適底物比。

圖6 底物比對反應過程中LPC轉化率的影響Fig．6 Effect of substrate ratio on LPC conversion during reaction

2．2．5 溶劑比對乙醇解反應的影響

溶劑比過低時，底物濃度較高，體系黏稠傳質阻力增大，酶催化反應受到底物抑制作用;溶劑比過高時，會降低底物與酶的碰撞機率，從而影響反應速率。實驗發現溶劑比對LPC轉化率的影響并不顯著，反應趨勢基本一致(圖7)。

圖7 溶劑比對反應過程中LPC轉化率的影響Fig．7 Effect of solvent ratio on LPC conversion during reaction

從節約生產成本考慮，溶劑比越低越好，但溶劑比過低會使溶液粘度過大，體系不會很好的混合，且妨礙取樣的準確性［21］。綜上，選擇1∶2(PC∶正己烷，g∶mL)為最適溶劑比。與王渝鷺等［11］的研究結果相比，醇解反應達到平衡所用的時間減少了一半，反應速率大大提高，這與 Hass等［21］和 Shaw 等［23］報道一致，無溶劑體系中醇解反應速率較正己烷中進行較快。

2.3 其他醇對卵磷脂乙醇解的影響

通過單因素實驗，確定了有機溶劑體系下脂肪酶Lipozyme RM IM催化大豆卵磷脂乙醇解制備溶血卵磷脂的適宜條件:溫度40℃，加酶量15%(以PC質量計)，溶劑比 1∶2(PC∶正己烷，g∶mL)，底物比 1∶3(PC∶醇中羥基，mol∶mol)，加水量 1∶80(PC∶水，g∶μL)。

在此基礎上，考察其他醇對卵磷脂乙醇解的影響。從醇的碳鏈長度、醇的級別出發，綜合考慮經濟因素，選擇X醇為正丁醇、叔丁醇、1，2-丙二醇和丙三醇。乙醇與X醇的比例為X醇羥基占醇溶液總羥基摩爾數的百分比。

2．3．1 正丁醇對PC乙醇解反應的影響

向乙醇溶液中添加羥基摩爾比為10%、20%和30%的正丁醇，發現其反應速率和LPC轉化率隨反應時間的變化與乙醇解基本一致(圖8)，正丁醇對卵磷脂乙醇解無明顯作用。

圖8 乙醇與正丁醇相互作用對LPC轉化率的影響Fig．8 Effect of interaction of ethanol and n-butanol on the PLC conversion

Rodrigues等［24］研究了無溶劑體系下幾種脂肪酶催化油脂在短碳鏈醇中的酯交換反應，發現Lipozyme RM IM在低分子質量醇(甲醇、乙醇)中易失活，而在正丁醇中轉化率較高。本實驗結果與其不一致可能是由于底物組成及底物比不同，且乙醇和正丁醇在溶劑體系下被稀釋以致各自對酶的影響被削弱，同時正丁醇的空間結構與乙醇相近，雖然碳鏈長度較乙醇略有增長，但在最適乙醇解條件下其分子動能與傳質能力并未受到影響。正丁醇對卵磷脂的乙醇解未表現出明顯的促進或抑制作用。

2．3．2 叔丁醇對PC乙醇解反應的影響

近年來，在酶促油脂酯交換制備生物柴油的研究中，叔丁醇的使用備受重視。甲醇等短碳鏈醇與油脂的溶解性不好且易使酶失活，加之醇解反應產物甘油對酶有毒害作用，使得酯交換率較低［25］。叔丁醇因其對甲醇和甘油等溶解性較好，有助于酶的激活并使固定化脂肪酶穩定性增強，而廣泛用作酶促酯交換反應介質［26-27］。本實驗向乙醇溶液中添加不同羥基摩爾比的叔丁醇，發現其反應速率和LPC轉化率隨反應時間的變化與乙醇解基本一致，叔丁醇對卵磷脂乙醇解未表現出顯著地促進或抑制作用(圖9)。

圖9 乙醇與叔丁醇相互作用對LPC轉化率的影響Fig．9 Effect of interaction of ethanol and t-butanol on the PLC conversion

卵磷脂醇解不同于甘三脂醇解中叔丁醇所表現出的積極作用，可能是因為底物的不同，卵磷脂比甘三脂極性大，對醇的溶解性好，且反應過程中甘油產生量很小。另外，叔丁醇與乙醇相比，支鏈結構使其分子中羥基受到的空間位阻較大，因此可能導致底物碰撞機率的減少。

2．3．3 1，2-丙二醇對 PC 乙醇解反應的影響

反應初期PC乙醇解速率受丙二醇的影響不大(圖10)，因反應初始階段溶劑體系下底物與酶之間尚處飽和狀態，在傳質能力較強的情況下底物間的差異還未表現出來。反應一段時間后，隨著丙二醇添加比例的增大，反應速率和LPC轉化率都隨之降低，主要原因是含相同摩爾量的羥基時，與乙醇相比丙二醇分子體積較大，在溶液中傳動能力差。且丙二醇極性較大，在非極性的正己烷中溶解性和分散性較差，不利于反應底物的接觸。隨著添加比例繼續增大至20%、30%時，丙二醇對乙醇解的抑制作用不再增加，可能是由于丙二醇分子中羥基占分子體積的比例較大，有利于它與磷脂和酶的接觸。Nelson等［28］研究發現，在正己烷溶劑中，Lipozyme RM IM在直鏈醇中的催化活性比在支鏈醇中好。溶劑體系下丙二醇對卵磷脂的乙醇解反應表現出一定的抑制作用。

圖10 乙醇與1，2丙二醇相互作用對LPC轉化率的影響Fig．10 Effect of interaction of ethanol and α-propelene glycol on the PLC conversion

2．3．4 丙三醇對PC乙醇解反應的影響

同丙二醇相似，丙三醇對PC的乙醇解反應也有一定的抑制作用(圖11)。

有報道說甘油可能會由于傳質限制而降低固定化酶活性［29-30］。脂肪酶在正己烷中有較高活性，但丙三醇在其中溶解性不好，會被固定化酶吸附堵塞通道，抑制反應。

3 結論

有機溶劑體系下，通過單因素實驗確定了脂肪酶Lipozyme RM IM催化大豆卵磷脂乙醇解制備溶血卵磷脂的最適反應條件:溫度40℃，加酶量15%(以PC 質量計)，溶劑比1∶2(PC∶正己烷，g∶mL)，底物比1∶3(PC∶醇中羥基，mol∶mol)，加水量 1∶80(PC∶水，g∶μL)。在此基礎上，考察醇的相互作用對卵磷脂乙醇解的影響，發現正丁醇和叔丁醇對PC乙醇解無明顯影響，1，2-丙二醇和丙三醇對PC乙醇解表現出抑制作用。

圖11 乙醇與丙三醇相互作用對LPC轉化率的影響Fig．11 Effect of interaction of ethanol and glycerol on the PLC conversion

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