黑曲霉DL08內切葡聚糖酶基因的克隆表達及酶學性質研究*

王曉輝，張慶芳，遲乃玉

(大連大學生命科學與技術學院，遼寧大連，116622)

纖維素是公認的地球上分布最廣、含量最豐富的可再生資源，利用廉價的可再生木質纖維素可轉化成葡萄糖，并進一步生成可再生生物能源如乙醇或其他有用物質等。工業生產中主要采用濃硫酸等將長鏈多聚物纖維素降解為單糖，但所用強酸造成環境嚴重污染，因此亟需高效率、無污染的纖維素酶替代化學方法。但目前纖維素酶催化效率較低、生產成本較高，影響了纖維素酶工業化生產和廣泛應用［1］。

纖維素酶是能夠降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱。主要分為3類:內切葡聚糖酶(endo-1，4-β-D-glucanase，EC3．2．1．4，EG)、外切葡聚糖酶或纖維二糖水解酶(exo-1，4-β-D-glucanases，EC3．2．1．9，CBH) 和 β-葡 萄 糖 苷 酶 (β-glucosidases，EC3．2．1．21，BG)［2-3］。纖維素酶水解纖維素是纖維素酶3種組分協同作用的結果:EG負責進攻纖維素的非結晶區，隨機水解β-1，4-糖苷建，將長鏈纖維素分子截短，產生大量帶非還原性末端的小分子纖維素;CBH負責從纖維素線狀分子非還原性末端水解切下纖維二糖單位;BG則將纖維二糖水解為葡萄糖，使纖維素完全降解。由于纖維素多樣性及高度復雜性，纖維素酶系降解機理還有待進一步研究［4-5］。

為了研究纖維素酶之間的協同作用，需要獲得各種純的纖維素酶制劑。已報道從黑曲霉真菌培養液中分離純化天然纖維素酶［6-8］，但常常存在其他微量多糖水解酶的干擾，最好的辦法是利用基因工程菌表達纖維素酶。很多纖維素酶在真核細胞表達系統如酵母細胞或絲狀真菌細胞中成功表達，但絲狀真菌細胞存在內源纖維素酶干擾問題，酵母細胞中也發現存在內源果膠酶，影響外源基因表達［9-10］，因而探討纖維素酶在原核細胞中異源表達有重要意義。內切葡聚糖酶是纖維素酶系的重要組成部分，占表達的纖維素酶總量的5%～10%，是最重要的內切酶之一，它具有很高的催化活性，被廣泛用于紡織、印刷、染料、造紙和洗滌等工業［11］。本文報道來自黑曲霉(Aspergillus niger)DL08內切葡聚糖酶基因首次在大腸桿菌中異源重組表達，并對其酶學性質進行研究，為實現其與外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶基因重組并在一個強啟動子調控下完成基因串聯表達，最終獲得纖維素高效降解工程菌鑒定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種、質粒和培養條件

黑曲霉(A．niger)DL08菌株由本實驗室分離并保存;大腸埃希氏菌(Escherichia coli)DH5α和BL21(DE3)為本實驗室保存，分別為基因克隆和表達宿主菌;質粒 pMDl9-T(TaKaRa)用作克隆載體，pET28a(Novagen)用作表達載體;引物合成和基因測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 內切葡聚糖酶基因的克隆與轉化

PDA液體培養基活化黑曲霉菌種，取1 mL接入50 mL誘導培養基中，28℃培養48 h后離心收集菌體。用濾紙吸干水分后，加入液氮研磨至粉末狀，按照Takara公司的RNA抽提試劑抽提黑曲霉總RNA，并采用cDNA合成試劑盒得到 cDNA。根據 Jiong等［12］發表的內切葡聚糖酶基因序列(GeneBank AF331518)設計引物，正義引物(5’-GAATTCATGAGGCTTCAGAGCACTCTGCTTCTTG-3’)包含EcoRⅠ限制性酶切位點，反義引物(5’-AAGCTTTCAGCGATATGCCTC CAGGAT-3’)包含HindⅢ限制性酶切位點，使用PrimeSTARTMHS DNA Polymerase(Takara)擴增得到不含信號肽的內切葡聚糖酶基因cDNA序列。將該cDNA序列連接到pMDl9-T載體，構建pMDl9-T-eg1質粒轉化至E．coli DH5α，得到陽性轉化子。用限制性內切酶EcoRⅠ和HindⅢ將eg1基因片段從pMDl9-T-eg1上切下，連接到pET-28a表達載體上，轉化至E．coil BL21(DE3)，通過菌落PCR、酶切篩選鑒定陽性克隆子，命名為pET28a-eg1。

1.3 內切葡聚糖酶基因的表達與純化

將重組E．coil BL21(DE3)接入含卡那的LB培養基中，37℃過夜培養14 h。按1%的接種量接種到含卡那的LB培養基中。當OD600nm達到0．8左右，加入0．2 mmol/L的IPTG，15 ℃，100 r/min低溫誘導6 h。誘導表達結束后，4℃，5，000×g，4 ℃離心 5 min，收集菌體，用10 mL，20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl(pH 8．0)洗滌菌體3次。最后用10 mL含1 mmol/L DTT，1 mmol/L PMSF，20 mmol/L Tris-HCl和50 mmol/L NaCl(pH8．0)的緩沖液重懸菌體。離心管置于冰上超聲(400 W)破碎3次，每次30 s，每次間隔1min。4℃，8 000×g離心20 min，收集上清液，即為粗蛋白。粗蛋白用Ni2+-NTA柱(Novagen)進行親和層析純化，洗脫的蛋白液轉至透析袋(25 mm×16 mm，Sigma-Aldrich)在50 mmol/L Tris-HCl(pH 5．0)緩沖液中4℃過夜透析。蛋白樣品經變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)［13］檢測，其中濃縮膠濃度5%，分離膠濃度12%，用考馬斯亮藍R-250染色。低分子量蛋白 Marker(TakaRa)用于 SDSPAGE。

1.4 蛋白質濃度測定

蛋白濃度通過Bradford蛋白濃度測定試劑盒(Bradford Protein Assay Kit)(碧云天公司)測定。

1.5 內切葡聚糖酶酶學性質測定

1．5．1 內切葡聚糖酶的酶活測定

內切葡聚糖酶活性采用3，5-二硝基水楊酸試劑(DNS)法［14］測定。反應體系為:0．3 mL，50 mmol/L Tris-HCl buffer(pH8．5)，90 μL，1% 羧甲基纖維素鈉和適量重組內切葡聚糖酶，45℃反應30 min。加0．8 mL，0．4 mmol/L DNS試劑終止反應，100 ℃ 加熱 10 min顯色，然后檢測在520 nm處的吸收值，根據標準曲線回歸方程，得到還原糖濃度。酶活力單位(U)定義為:在上述條件下每分鐘催化底物生成1 μmol還原糖所需酶量為1個活力單位。

1．5．2 內切葡聚糖酶反應的最適溫度和溫度穩定性

將加入羧甲基纖維素鈉的酶液在30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80 ℃下反應 30 min 測酶活，確定酶反應的最適溫度。將最高酶活定義為100%。熱穩定性的測定是將酶液分別置于30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80 ℃下保溫1 h 測酶活，將最高酶活定義為100%。

1．5．3 內切葡聚糖酶反應的最適pH和pH穩定性

最適pH測定所用緩沖液為:50 mmol/L phosphate-citrate(pH 4．0～5．0)，50 mmol/L Tris – HCl(pH 6．0～10．0)，反應體系為:90 μL，1% 羧甲基纖維素鈉，10 μL 酶液，300 μL 不同 pH 的緩沖液，45 ℃反應30 min測酶活，將最大酶活設為100%。pH穩定性的測定:將酶保存于不同pH值的緩沖液中，于4℃放置24 h后在最適pH值和最適溫度下測定酶活，以酶活最高為100%。

1.6 酶作用產物分析

硅膠薄層層析(TLC)法分析酶解產物。水解條件:1%羧甲基纖維素鈉，0．1 mg重組內切葡聚糖酶和0．01%(w/v)NaN3，45 ℃反應，分別于 4，8，12 和24 h取樣。各取10 μL點樣于薄層層析硅膠板上，用丙酮∶異丙醇∶水 =6∶3∶1．5作為展開劑，用吹風機吹干硅膠板，均勻噴灑顯色劑(4 g二苯胺，4 mL苯胺與20 mL，85%磷酸溶于200 mL丙酮)，180℃烘烤3 min，顯色。lmg/mL葡糖糖作為標準液。

2 結果與分析

2.1 內切葡聚糖酶基因的克隆與鑒定

以黑曲霉(A．niger)總RNA為模板，RT-PCR擴增，得到1條長度約1000bp的 DNA片段(圖1)。DNA測序結果表明:該基因包含999個核苷酸構成的開放閱讀框架，命名為eg1，該基因編碼332個氨基酸，GC 堿基含量為53．95%，理論分子量36．75 kDa，等電點為4．38。Blast比對分析該序列同已發表A．niger內切葡聚糖酶 (GeneBank No．AF331518)氨基酸同源性達96%。已將此基因登陸GenBank，序列號為KJ437592。結構域分析［17］該基因包含一段18個氨基酸構成的信號肽，屬于糖苷水解酶5家族。將目的基因eg1連接表達載體pET28a，酶切鑒定成功構建表達載體pET28a-eg1(圖2)。

圖1 內切葡聚糖酶基因的PCR擴增Fig．1 Agarose gel electrophoresis of the eg1 gene through PCR

圖2 重組質粒酶切產物回收Fig．2 Enzyme digestion of plasmid pET28a-eg1

2.2 重組內切葡聚糖酶表達與純化

重組表達質粒載體pET28a-eg1轉化至宿主菌E．coli BL21(DE3)，0．2 mmol/L IPTG，100 r/min，15℃低溫誘導表達6 h，超聲破碎后蛋白5．23 mg，全部以可溶蛋白表達，未見包涵體形式，表明該重組蛋白成功表達(見圖3)，比活力為68．9 U/mg。利用設計好的內切葡聚糖酶基因C端融合6個組氨酸標簽，通過Ni+-NTA親和層析法純化分離重組內切葡聚糖酶(見圖4)。SDS-PAGE檢測顯示該重組蛋白純化后得到單一條帶，大小約36 kDa，與預期大小一致。蛋白含量2．85 mg，純化倍數為1．31，回收率達59．2%，比活力高達 90．3 U/mg(見表 1)。

圖3 重組內切葡聚糖酶蛋白SDS-PAGE檢測結果Fig．3 Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)of the recombinant eg1

表1 內切葡聚糖酶重組蛋白純化總結Table 1 Purification summary of the recombinant eg1

2.3 重組內切葡聚糖酶酶學性質研究

由圖5(a)可以看出，反應溫度在40～60℃時該酶有較高的活性，溫度低于40℃或者高于60℃，酶促反應速率顯著下降，酶的最適反應溫度為45℃;30～60℃區間酶的穩定性較好，其相對酶活都大于80%，說明該酶具有較好的熱穩定性;由圖5(b)可以看出，該酶最適 pH為5．0，pH大于7．0酶的活力有所下降;該酶在3．0～12．0范圍內有較好的活性，保持50%以上的酶活性，pH在表明內切葡聚糖酶pH耐受性范圍較廣。

圖5 內切葡聚糖酶重組蛋白酶學特性Fig．5 Enzymatic profiles of recombinant endo-β-1，4-glucanase eg1．

2.4 重組內切葡聚糖酶酶解產物分析

純化的重組蛋白eg1在45℃酶解1%羧甲基纖維素鈉，分別于2，4，12，24 h 取 10 μL 溶液進行產物分析。以l mg/mL的葡萄糖為標準液(見圖4)，從圖4看出，該酶的酶解產物為連續的寡糖，而非單一分子質量的單糖產物，說明該酶為內切葡聚糖酶。

3 討論

異源表達蛋白尤其是來自真核生物的蛋白在大腸桿菌中往往不能正確折疊，而聚集成不溶性的形式即包涵體，造成這些蛋白在大腸桿菌中不能正確表達［15］。研究者采用很多措施改善或提高蛋白的正確折疊效率包括共表達同源或異源的折疊輔助蛋白、菌體培養條件的優化及表達融合蛋白等，其中培養條件的優化是最簡單有效促進蛋白正確折疊的方法，包括誘導劑濃度、培養溫度或搖床轉數等方面，而優化低溫誘導是一種常見有效的提高蛋白折疊的策略，其原理可能涉及很多因素，如蛋白自聯作用力的減弱、蛋白合成速度的降低以及多肽鏈折疊動力學的改變等［16］。本研究中內切葡聚糖酶在37℃誘導表達時重組蛋白幾乎全部以不溶性的包涵體形式表達，當采用15℃低溫誘導表達可溶性的重組蛋白。

圖6 內切葡聚糖酶酶解產物薄層層析Fig．6 TLC analysis of the oligosaccharides from the endo-β-1，4-glucanase hydrolysates

本研究內切葡聚糖酶以羧甲基纖維素鈉為底物測酶活，比活力達90．3 U/mg，最適作用溫度45℃，為中溫酶;最適 pH 為 5．0，在 pH 3．0～12．0 酶活較穩定，即使在強堿性環境下仍保持50%以上的活性。以羧甲基纖維素鈉為底物分析水解產物表明4h的酶解產物已產生淡淡斑點，即產生連續低聚寡糖，12和24 h酶解產物相比4 h產生更多斑點，說明隨著酶解反應的進行產生濃度更高的低聚寡糖，12 h與24 h酶解產物的斑點并未明顯區別，表明該酶于12 h已反應完全，所以24 h的酶解產物在TLC板上并未產生新的斑點，即未產生新的相應低聚寡糖。本研究內切葡聚糖酶酶解1%羧甲基纖維素鈉終產物為連續寡糖，并非單一分子質量的單糖，說明該酶為內切葡聚糖酶。

本研究利用誘導型T7啟動子控制內切葡聚糖酶基因在大腸桿菌中實現了過量表達，初步研究重組蛋白的酶學特性，并對其降解產物進行定性分析，目前正在對該酶的酶學性質作更深入的研究，為實現其與外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶基因重組并在一個強啟動子調控下完成基因串聯表達，最終獲得纖維素高效降解工程菌鑒定基礎。

［1］Vaaje-Kolstad，G，Westereng B，Horn SJ，et al．An oxidative enzyme boosting the enzymatic conversion of recalcitrant polysaccharides［J］．Science，2010，330(6001):219-222．

［2］Westereng B，Ishida T，Vaaje-Kolstad G，et al．The putative endoglucanase PcGH61D from Phanerochaete chrysosporium is a metal-dependent oxidative enzyme that cleaves cellulose［J］．PLoS ONE，2011，6(11):1-11．

［3］LI Yanhong，YIN Qiuyu，DING Ming，et al．Purification，characterization and molecular cloning of a novel endo-β-1，4-glucanase AC-EG65 from the mollusc Ampullari acrossean［J］．Comparative Biochemistry and Physiology Part B:Biochemistry and Molecular Biology，2009，153(2):149-156．

［4］SW Kang，YS Park，JS Lee，et al．Production of cellulases and hemicellulases by Aspergillus niger KK2 from lignocellulosic biomass［J］．Bioresource Technology，2004，91(2):153-156．

［5］Alinda A Hasper，Ester Dekkers，Marc van Mil，et al．EglC，a New Endo-β-1，4-glucanase from Aspergillus niger with major activity towards xyloglucan［J］．Applied and Environmental Microbiology，2002，68(4):1 556-1 560．

［6］HUANG Xiaomei，FAN Jinxia，YANG Qian，et al．Cloning，Expression，and characterization of endo-β-1，4-glucanase gene egIV from Trichoderma viride AS 3．3711［J］．Journal of Microbiology and Biotechnology，2012，22(3):390-399．

［7］LIN Ling，MENG Xin，FU Peng，et al．Improved catalytic efficiency of endo-β-1，4-glucanase from Bacillus subtilis BME-15 by direct evolution［J］．Applied and Environmental Microbiology，2009，82:671-679．

［8］Dominic DW，WS Wong，Victor J Chan，et al．A novel xyloglucan-specific endo-β-1， 4-glucanase:biochemical properties and inhibition studies［J］．Applied and Environmental Microbiology，2010，86:1 463-1 471．

［9］QIN Yuqi，WEI Xiaomin，LIU Xiangmei，et al．Purification and characterization of recombinant endo-β-1，4-glucanase of Trichoderma reesei expressed in Saccharomyces cerevisiae with higher glycosylation and stability［J］．Protein Expression and Purification，2008，58(1):162-167．

［10］LIU J，LIU W，ZHAO X，et al．Cloning and functional characterization of a novel endo-β-1，4-glucanase gene from a soil-derived metagenomic library［J］．Applied Microbiology and Biotechnology，2011，89(4):1 083-1 092．

［11］Svein Jarle Horn，Gustav Vaaje-Kolstad，Bj?rge Westereng，et al．Novel enzymes for the degradation of cellulose［J］．Biotechnology for Biofuelsa，2012，5(45):1-12．

［12］Jiong hong，hisanori Tamaki，Shunichi Akiba，et al．Cloning of a gene encoding a highly stable endo-β-1，4-glucanase from Aspergillus niger and its expression in yeast［J］．Journal of Bioscience and Bioengineering，2001，92(5):434-441．

［13］Laemmli，U．K．Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4［J］．Nature，1970，227(5259):680-685．

［14］Miller GL．Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar［J］．Analytical Chemistry，1959，31:426–428．

［15］Schultz J，Copley RR，Doerks T，et al．SMART:a webbased tool for the study of genetically mobile domains［J］．Nucleic acids research，2000，28(1):231-234．

［16］Harming G，Makrides S C．Strategies for optimizing heterologous protein expression in Escherichia coli［J］．Trends in Biotechnology，1998，16(2):54-60．