電子自旋共振法與可見分光光度法對比測定葛根黃酮抗氧化性*

李銀花，王海波，李洪燕

1(廣東食品藥品職業學院，廣東廣州，510520)3(廣州市質量監督檢測研究院，廣東廣州，510110)

葛根，生于荒山山坡、林地邊緣、曠野路邊、溪邊，常纏繞在其他植物上，生長快，對氣候及土質要求不高，性喜溫暖、潮濕環境，但亦耐旱［1-3］?，F被國家衛生部列入“藥食兩用”中藥名錄中，傳統醫學上用之入藥，因富含淀粉，也一直是我國居民的傳統食品［4-5］。實驗研究證明，葛根中的有效成分為異黃酮類化合物，而葛根素是其中的主要成分［7-8］。

電子自旋共振技術(ESR)是一種新的檢測物質抗氧化性的方法，通過測定物質中自由基信號的改變來表現自由基的變化［8-9］。本文采用ESR對葛根黃酮進行測定，同時與可見分光光度法進行對比，探討不同濃度葛根黃酮在質量濃度差下對DPPH·的消除效應。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛根藥材，由廣州二天堂藥店提供，廣東省中藥研究所鑒定為粉葛(P．thomsonii Benth)的干燥根;葛根素標準品，中國藥品生物制品檢定所;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，美國Sigma公司;乙醇、甲醇、香蘭素，均為分析純。

1.2 儀器與設備

A300電子順磁共振波譜儀，德國Bruker公司;752-紫外分光光度計，上海分析儀器廠;FW100型高速萬能粉碎機、藥典檢驗篩 GB6003-95:3號篩(0．355mm)、電子分析天平，梅斯特-拖利多儀器上海有限公司;電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司;KQ-SOOB型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1．3．1 樣品制備［10-11］

稱取一定量葛根，粉碎，過3號篩，得葛根粉末。精密取2g葛根粉末，經超聲波輔助提取得620．34 mg葛根粗提取物(crude extract purain，CEP)。取定量葛根粗提取物，經大孔樹脂吸附，分別用體積分數(下同)30%、60%的乙醇溶液洗脫。將部分60%乙醇洗脫液濃縮，凍干成葛根黃酮粉末，按表1標記，置于冰箱4℃中保存，待用。

表1 葛根產品標記Table 1 Example of a double column table

1．3．2 葛根黃酮含量測定-可見分光光度法［12-13］

標準曲線試驗方法:取30 mg葛根素標準品溶于蒸餾水中，定容至 500 mL，分別從中精密量取2．0、4．0、6．0、8．0、10．0 mL，再用蒸餾水定容至 100 mL。以蒸餾水為參比溶液，于250 nm處測定吸收值，以對照品濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線，計算出回歸方程。

標準曲線回歸方程:Y=0．037 7+84．966x，r=0．993。其中，x，葛根素的濃度(mg/mL);Y，吸光度值;r，線性相關系數。

結果表明葛根素在0．001 2～0．006 0 mg/mL質量濃度范圍內線性關系良好。

1．3．3 ESR 測定 DPPH·清除率

圖1 葛根素標準工作曲線Fig．1 The standard working curve of Puera rin

電子順磁共振波譜儀參數設置:溫度25℃;調制頻率 150．0 kHz;條幅2．1G;時間常數330．120 ms;掃場時間 650．500 s;中心磁場 3 800．00 G;掃場寬度85．00G;X 波段頻率10．124 7 GHz;功率20．000 mW。

用95%乙醇溶液做溶劑，將1．3．1的4個樣品分別稀釋成10、20、40、60、80 mg/L 溶液，取 1．00 mL 2．5×10-4mol/mL的DPPH溶液混合，搖勻。將混合液裝入毛細管中并封閉好，置于電子順磁共振波譜儀諧振腔中，記下波譜圖，計算波峰面積，用95%的乙醇溶液做出空白試驗。

1．3．4 可見分光光度法檢測DPPH·清除率

在517 nm處測定吸光度值，按公式計算:

A1:依次量取2．5×10-4mol/mL的DPPH溶液2．00 mL，分別加入 2．00 mL 10、20、40、60、80 mg/L樣品溶液，充分搖勻后，暗置30 min，待測。

A2:量取蒸餾水 2．00 mL，分別加入 2．00 mL10、20、40、60、80 mg/L 樣品溶液，充分搖勻后，暗置 30 min，待測。

A3:取 2．00 mL 95%乙醇溶液加入 2．00 mL 2．5×10-4mol/mL DPPH溶液，搖勻測量。

2 結果與分析

2.1 ESR法測定葛根黃酮自由基清除效果

2．1．1 10 mg/L葛根黃酮樣品自由基清除效果

10 mg/L葛根黃酮樣品(CEP1，CEP2，CEP3，CEP4)，在進樣后0，15，30 min內測得清除 DPPH·波譜圖，如圖2所示。

由圖2與圖3可知，10 mg/L葛根黃酮在電子順磁共振中，自由基特有的吸收波段主要在3 660～3 840 G之間。4份樣品DPPH·的清除率均不高，但隨著時間的延長，清除自由基的能力均有略微的提高，其中60%乙醇洗脫液凍干粉清除DPPH·的能力最強。30 min與15 min處理時間相比，4份樣品30 min 處理，清除率分別提高了 26．6%，16．7%，8．9%，21．4%。

圖2 10 mg/L葛根黃酮4份樣品清除DPPH·波普圖Fig．2 10 mg/L puerarin flavonoids four samples scavenging DPPH free radicals

2．1．2 20 mg/L葛根黃酮樣品自由基清除效果

取20 mg/L葛根黃酮樣品(CEP1，CEP2，CEP3，CEP4)，在進樣后0，15，30 min內測得清除DPPH自由基波普圖，如圖4、圖5所示。

圖3 10 mg/L葛根黃酮4份樣品清除DPPH·能力圖Fig．3 10 mg/L Puerarin flavonoids four samples DPPH radical scavenging activity diagram

圖4 20 mg/L葛根黃酮4份樣品清除DPPH·波普圖Fig．4 20 mg/L Puerarin flavonoids four samples scavenging DPPH free radicals

圖5 20 mg/L葛根黃酮4份樣品清除DPPH·能力圖Fig．5 20 mg/L Puerarin flavonoids four samples DPPH radical scavenging activity diagram

由圖4和圖5可知，20 mg/L葛根黃酮4份樣品清除DPPH自由基能力有所提高。在反應時間段為15 min，20 mg/L葛根黃酮4份樣品 CEP1，CEP2，CEP3，CEP4 分別提高了 20．5%，22．0%，30．4%，40．5%。同樣，60%乙醇洗脫液凍干粉清除自由基的能力最強。2個時間段相比，30 min比15 min處理清除率分別提高了 36．6%，37．7%，21．9%，31．4%。

2．1．3 40 mg/L葛根黃酮樣品自由基清除效果

40 mg/L葛根黃酮樣品(CEP1，CEP2，CEP3，CEP4)，在進樣后0，15，30 min內測得清除 DPPH·波普圖，如圖6、圖7所示。

由圖6和圖7可以看出，在反應15 min，40 mg/L葛根黃酮4份樣品CEP1，CEP2，CEP3，CEP4較20 mg/L葛根黃酮樣品自由基清除率分別提高了30．5%，33．0%，40．4%，50．5%。同樣，60% 乙醇洗脫液凍干粉清除自由基的能力最強。2個時間段相比，30 min比15 min處理清除率分別提高了56．6%，57．7%，61．9%，71．4%。

2．1．4 60 mg/L葛根黃酮樣品自由基清除效果

60 mg/L葛根黃酮樣品(CEP1，CEP2，CEP3，CEP4)，在進樣后0，15，30 min內測得清除 DPPH·波普圖，如圖8、圖9所示。

由圖8和圖9可以看出，在反應時間段為15 min，60 mg/L葛根黃酮 4份樣品 CEP1，CEP2，CEP3，CEP4較40 mg/L葛根黃酮樣品自由基清除率分別提高了 70．5%，63．0%，60．4%，70．5%。2 個時間段相比，30 min比15 min處理清除率分別提高了66．6%，67．7%，71．9%，81．4%。60% 乙醇洗脫液凍干粉清除自由基的能力最強。在反應30 min時，自由基清除率達到了95%。

2．1．5 80 mg/L葛根黃酮樣品自由基清除效果

80 mg/L葛根黃酮樣品(CEP1，CEP2，CEP3，CEP4)，在進樣后0，15，30 min內測得清除 DPPH·波普圖，如圖10、圖11所示。

圖6 40 mg/L葛根黃酮4份樣品清除DPPH·波普圖Fig．6 40 mg/L Puerarin flavonoids four samples scavenging DPPH free radicals

圖7 40 mg/L葛根黃酮4份樣品清除DPPH·能力圖Fig．7 40 mg/L Puerarin flavonoids four samples DPPH radical scavenging activity diagram

圖8 60 mg/L葛根黃酮4份樣品清除DPPH·波普圖Fig．8 60 mg/L Puerarin flavonoids four samples scavenging DPPH free radicals

由圖10和圖11可以看出，80 mg/L葛根黃酮4份樣品清除率均有大幅提高。在反應時間段為15 min，80 mg/L葛根黃酮 4份樣品 CEP1，CEP2，CEP3，CEP4較60 mg/L葛根黃酮樣品自由基清除率分別提高了 60．5%，67．0%，70．4%，60．5%。2 個時間段相比，30 min比15 min處理清除率分別提高了36．6%，37．7%，31．9%，41．4%。60% 乙醇洗脫液凍干粉清除自由基的能力最強。在反應30 min時，自由基清除率幾乎達到了100%。

圖9 60 mg/L葛根黃酮4份樣品清除DPPH·能力圖Fig．9 60 mg/L Puerarin flavonoids four samples DPPH radical scavenging activity diagram

圖10 80 mg/L葛根黃酮4份樣品清除DPPH·波普圖Fig．10 80 mg/L Puerarin flavonoids four samples scavenging DPPH free radicals

圖11 80 mg/L葛根黃酮4份樣品清除DPPH·能力圖Fig．11 80 mg/L Puerarin flavonoids four samples DPPH radical scavenging activity diagram

從上述情況來看，不管在15 min或是30 min，在相同的質量濃度下，60%乙醇洗脫液凍干粉CEP4對自由基的清除率都是最高，由此說明了葛根的60%乙醇洗脫液凍干粉對抗氧化能力最強;同時在一定質量濃度范圍內，葛根素提取液對自由基的清除率出現劑量效應，在比較低質量濃度時，對自由基的清除能力比較弱，隨著質量濃度的升高，自由基的清除能力也相應的提高。當質量濃度為60 mg/L，對自由基的清除率出現了大幅度的提高，其平均清除率達到了90%，其原因主要是在不同提取液中葛根素的含量不同。從反應時間來看，相同的質量濃度，30 min處理時間對自由基的清除率均高于15 min的清除率。其主要原因是反應時間過短，樣品中的葛根素與自由基沒能完全進行結合。在反應30 min，不夠量的樣品也沒有辦法將自由基完全清除。而80 mg/L60%乙醇洗脫液凍干粉(CEP4)自由基清除率達到了100%，自由基清除效果最好。

2.2 可見分光光度法測定葛根素對自由基清除率的結果

圖12 4份葛根樣品對DPPH·的清除效果圖Fig．12 Samples for four DPPH radical scavenging effect diagram

從圖12中可以知道，可見分光光度法測定的4種不同葛根素提取液均有清除自由基的能力，同時樣品質量濃度提高對應的自由基清除率也提高，4份樣品對自由基清除能力大小分別是CEP4＞CEP3＞CEP2＞CEP1，其中60%乙醇洗脫液凍干粉在不同濃度和不同處理時間上效果最好。分光光度法與ESR法測得的4份樣品清除率來比較，相同時間，相同濃度下，分光光度法普遍低于ESR法測得的4份樣品清除率。這說明ESR更能靈敏地反應出葛根素對自由基的清除能力。

3 結論

本研究采用了可見分光光度法和電子自旋共振檢測技術測定4份不同葛根素提取液對DPPH·清除能力的比較，得出葛根素有很強的抗氧化能力。在ESR測定法里，不同的反應時間，同一份樣品對DPPH·的清除率和質量濃度成正比例關系，在質量濃度為60 mg/L時，自由基的清除率有顯著的提高。ESR處理時間30 min，60%乙醇洗脫液葛根凍干粉自由基清除率可以達到100%。通過2種方法的比較，表明電子自旋共振檢測技術檢測自由基清除效果要明顯好于可見分光光度法，ESR法能更靈敏、更準確地測定自由基清除效果。

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