苦參素對食管癌Eca-109細胞BIP和CHOP mRNA表達的影響*

曹 珊，周慧茹，朱艷琴

1)河南中醫學院基礎醫學院 鄭州450046 2)河南中醫學院第二臨床醫學院 鄭州450002

#通訊作者，女，1956年11月生，碩士，教授，研究方向:腫瘤病理及中醫藥防治，E-mail:jc.zyqin@163.com

食管癌是消化系統常見腫瘤，特別是食管鱗狀細胞癌［1］。目前，中藥防治食管癌的研究已經取得了一定的成果，但苦參素促進人食管癌Eca-109 細胞凋亡分子機制的研究尚未見報道。該實驗通過觀察不同劑量的苦參素對體外培養的人食管癌Eca-109 細胞內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)途徑標志蛋白免疫球蛋白重鏈結合蛋白(immunoglobulin heavy chain binding protein，BIP)和C/EBP 環磷酸腺苷反應元件結合轉錄因子同源蛋白(CAAT/enhancer binding protein homologous protein，CHOP)mRNA 表達的影響，探討其促進Eca-109 細胞凋亡可能的作用靶點，為苦參素臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 食管癌Eca-109 細胞由鄭州大學公共衛生學院王凱娟教授饋贈。

1.1.2 主要藥品與試劑 苦參素注射液(上海第一生化藥業有限公司產品)，批號001244，規格2 g/L、2 mL/支;5-氟尿嘧啶(上海旭東海普藥業有限公司產品)，批號071001，規格2 g/L、10 mL/支;DMEM、胰蛋白酶(美國Gibco 公司產品);胎牛血清(杭州四季青公司產品);二甲基亞砜(上海化學試劑廠產品);碘化丙啶(PI，美國Sigma 公司產品);逆轉錄試劑盒、實時定量試劑盒、總RNA 提取試劑(日本TaKaRa 公司產品);引物由上海捷瑞生物技術公司設計并合成。

1.1.3 主要儀器 CO2恒溫培養箱(德國Heraeus公司)，FACS Calibur 流式細胞儀(美國BD 公司)，FLUOVIEW FV100 共聚焦熒光顯微鏡(日本Olympus 公司)，PCR 擴增儀(德國Whatman Biometra 公司)，實時定量PCR 儀(美國Applied Biosystem公司)。

1.2 Eca-109 細胞的培養、傳代 Eca-109 細胞常規培養于體積分數10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素的RPMI 1640 培養液中，在37℃、體積分數5% CO2和充分濕度條件下培養，每3～4 d傳代1 次，取對數生長期細胞用于實驗。

1.3 實驗分組與給藥 實驗細胞分為空白對照組、5-氟尿嘧啶組和苦參素組。其中苦參素組按藥物劑量不同分為苦參素高劑量(2.0 g/L)、中劑量(1.0 g/L)、低劑量(0.5 g/L)3組;5-氟尿嘧啶組用藥劑量為2 g/L;空白對照組僅加入等體積的培養液，不加藥物。培養48 h 后，收集細胞。

1.4 Eca-109 細胞增殖能力的MTT 法檢測 取對數生長期細胞，制備細胞懸液。調整細胞濃度為1×104mL－1，接種于96 孔培養板內，每孔200 μL，預培養24 h。按1.3 實驗分組分別加入不同劑量藥物，每組設6 個復孔，培養48 h 后，加入MTT 液(5 g/L)20 μL/孔，繼續培養4 h，去上清，加入二甲基亞砜150 μL/孔，振蕩10 min，上酶標儀于490 nm處測吸光度值(A 值)。實驗重復3 次。

1.5 Eca-109 細胞凋亡率的Annexin V-PI 法檢測按試劑盒說明操作如下。各組用PBS 洗滌，2.5 g/L胰蛋白酶消化2～3 min，轉移至離心管中，加入培養液，混勻后1 000 r/min 離心4 min，棄上清，加PBS重懸細胞，調整細胞濃度為1×106mL－1，取0.5 mL上述細胞懸液，1 000 r/min 離心4 min，棄上清，加0.5 mL Binding Buffer 重懸細胞，加入1 μL 熒光標記的Annexin V 試劑，混勻后避光室溫下孵育20 min，加入5 μL PI，混勻后避光4℃條件下孵育5 min，加入500 μL Binding Buffer，上流式細胞儀檢測凋亡率。實驗重復3 次。

1.6 Eca-109 細胞BIP 和CHOP mRNA 相對表達量的實時熒光定量PCR 檢測 引物設計如下。βactin 上游引物序列5'-CTACAATGAGCTGGTGTGG-3'，下游引物序列5'-TAGCTCTTCTTCAGGGAGGA-3'，產物大小180 bp;BIP 上游引物序列5'-TCTAG GTGAACGACCCCTAAC-3'，下游引物序列5'-GT TCTCTCAATTTTCTCCCAAC-3'，產物大小648 bp;CHOP 上游引物序列5'-CGCCTTCAACGACGAGTTC CTG-3'，下游引物序列5'-GCTGTTCTTATCCAC CGACTTC-3'，產物大小503 bp。提取每組細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA。PCR 反應體系為10 μL:SYBR Green ⅠMixture 5 μL，上游引物0.25 μL，下游引物0.25 μL，模板cDNA 1 μL，ddH2O 3.3 μL，Rox 0.2 μL。反應條件:95℃預變性10 min;95℃變性30 s，58℃退火40 s，72℃延伸40 s，共45 個循環。每個樣本的RNA 含量均根據各自的β-actin 含量進行標準化，采用2－ΔΔCt法計算BIP 和CHOP mRNA 的相對表達量。實驗重復3 次。

1.7 統計學處理 采用SPSS 13.0 進行統計分析。各組間A 值、凋亡率、BIP 和CHOP mRNA 相對表達量的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 苦參素對Eca-109 細胞增殖能力和凋亡率的影響 結果見表1。與空白對照組比較，高、中、低劑量的苦參素和5-氟尿嘧啶均可抑制Eca-109 細胞增殖，促進Eca-109 細胞凋亡。

表1 各組Eca-109 細胞A 值和凋亡率的比較(n=3)

2.2 苦參素對Eca-109 細胞BIP 和CHOP mRNA表達的影響 結果見表2。與空白對照組比較，高、中、低劑量的苦參素和5-氟尿嘧啶均可下調BIP mRNA 表達，上調CHOP mRNA 表達。

表2 各組Eca-109 細胞BIP 和CHOP mRNA 相對表達量的比較(n=3)

3 討論

內質網是細胞內蛋白質合成、折疊的重要場所。低氧、葡萄糖饑餓、氧化和糖基化作用紊亂等刺激，可使未折疊或錯誤折疊的蛋白質積聚于內質網內，導致ERS。此時，細胞通過啟動未折疊蛋白反應，降低蛋白質合成速率、上調內質網伴侶蛋白表達來增加內質網的蛋白處理能力、減輕內質網負擔，以恢復細胞內環境的穩態，從而對細胞起到保護作用［2-3］。BIP 又稱葡萄糖調節蛋白78，是葡萄糖調節蛋白的主要成員，亦是駐留于內質網腔內的內質網標志分子伴侶，常作為ERS 的標志物，在輔助蛋白質折疊、調節ERS 跨膜信號蛋白活性等方面發揮著重要的作用。研究［4-5］表明，BIP 可結合未折疊的多肽鏈，具有協調蛋白質正確折疊和裝配的功能，可抑制蛋白質聚集并降低錯誤折疊蛋白質的分泌，促進細胞存活。正常情況下，BIP 與RNA 依賴性蛋白激酶樣內質網激酶、肌醇需求酶1、轉錄激活因子6 結合，使這3 種蛋白處于無活性狀態，而ERS 發生時，BIP釋放這3 種蛋白，從而導致3 種蛋白的激活，繼而誘導ERS 下游靶基因的表達［6］，包括CHOP。CHOP是ERS 凋亡途徑的關鍵因子，在ERS 誘導細胞凋亡中發揮促凋亡作用，在一定程度上反映細胞凋亡的水平。ERS 發生時CHOP 可通過轉錄抑制抗凋亡因子Bcl-2 的表達引起細胞凋亡。CHOP 介導的凋亡參與腫瘤、糖尿病、帕金森病等諸多疾病的發生和發展過程。研究［7］證實抗腫瘤藥物可通過上調CHOP的表達來誘導腫瘤細胞凋亡，同時CHOP 的過表達在增敏化療藥物中也起到了關鍵作用。因此，CHOP凋亡通路與腫瘤發生及治療的研究越來越受到關注。

苦參素是氧化苦參堿和極少量氧化槐果堿的混合物，是從豆科植物苦豆草的種子苦豆子或豆科植物苦參的根中提取的一種生物堿。苦參素具有抗病毒、抗炎、調節免疫等作用，對中樞神經系統、心血管系統亦有明顯的藥理作用。近年來研究［8］發現苦參素具有明顯的抑制腫瘤、調節腫瘤細胞周期及誘導腫瘤細胞分化等作用。該實驗結果證實苦參素可促進Eca-109 細胞凋亡，進一步支持苦參素抑制Eca-109 細胞增殖的理論;實時熒光定量PCR 檢測發現空白對照組細胞BIP mRNA 高表達，提示ERS參與Eca-109 細胞增殖過程。腫瘤組織由于生長過快，營養供應相對不足，而高表達的BIP 可拮抗內質網相關性細胞凋亡，使Eca-109 細胞在缺氧、酸中毒等微環境下得以耐受及生存。該研究中苦參素組細胞BIP mRNA 表達下調，提示苦參素抑制Eca-109細胞增殖的藥理作用與調控ERS 有關;苦參素組細胞CHOP mRNA 高表達，表明苦參素可放大ERS 凋亡信號，通過CHOP 轉錄激活誘導Eca-109 細胞凋亡，但CHOP 誘導凋亡的下游信號機制還需要進一步研究。

［1］赫捷，邵康.中國食管癌流行病學現狀、診療現狀及未來對策［J］.中國癌癥雜志，2011，21(7):501

［2］Chakrabarti A，Chen AW，Varner JD.A review of the mammalian unfolded protein response［J］.Biotechnol Bioeng，2011，108(12):2777

［3］Cao SS，Kaufman RJ.Unfolded protein response［J］.Curr Biol，2012，22(16):R622

［4］Sato M，Yao VJ，Arap W，et al.GRP78 signaling hub a receptor for targeted tumor therapy［J］.Adv Genet，2010，69:97

［5］Walter P，Ron D.The unfolded protein response:from stress pathway to homeostatic regulation［J］.Science，2011，334(6059):1081

［6］常曉東，甘華，杜曉剛，等.內質網應激在高脂血癥引起腎臟損害中的作用［J］.西安交通大學學報:醫學版，2010，31(1):79

［7］曹潔，楊朝霞，沈薇，等.內質網應激在軟脂酸鈉誘導的脂肪變性L02 肝細胞凋亡中的作用［J］.第三軍醫大學學報，2011，33(18):1935

［8］朱艷琴，王凱娟.苦參素注射液對Eca-109 細胞周期及CyclinD1、CDK4 蛋白表達的影響［J］.鄭州大學學報:醫學版，2008，43(6):1082