沉默GST-π基因表達對EC9706/cDDP細胞順鉑耐藥性的影響

唐 悅，軒小燕，柳璐璐，李 敏

鄭州大學基礎醫學院微生物學與免疫學教研室 鄭州450001

#通訊作者，女，1975年1月生，博士，副教授，研究方向:食管癌防治，E-mail:liminzzu@gmail.com

食管癌是發生在食管上皮組織的惡性腫瘤，占所有惡性腫瘤的2%。化療是腫瘤患者(包括術后患者)的主要治療手段之一。化療耐藥尤其是對最常用的鉑類化療藥物的耐藥限制了化療藥物的治療效果，也是引起腫瘤化療失敗及復發的主要原因［1-2］，因此逆轉化療耐藥的研究成為所有問題的焦點。谷胱甘肽S 轉移酶(glutathione S-transferase，GST)是一組具有復雜生理功能的蛋白質，主要參與機體的解毒［3］。近年來其亞型GST-π 成為腫瘤化療耐藥研究的新熱點［4-6］。作者前期的研究［7-8］表明人食管鱗狀細胞癌順鉑耐藥細胞系EC9706/cDDP 細胞中GST-π 的表達明顯增加，說明GST-π 與食管癌細胞的順鉑耐藥性有一定關系。為進一步研究GST-π 基 因 在 多 藥 耐 藥(multidrug resistence，MDR)形成中的作用及探索有效的MDR 逆轉方法，作者構建了靶向GST-π 基因的siRNA 重組慢病毒，轉染EC9706/cDDP 細胞，觀察細胞對化療藥物敏感性的改變，探討沉默GST-π 的表達是否會在一定程度上逆轉EC9706/cDDP 的順鉑耐藥性。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑 高分化EC9706/cDDP 細胞由鄭州大學基礎醫學院李敏老師的研究團隊保存。EC9706、慢病毒包裝細胞293FT、大腸桿菌DH5α 和pRNAT-U6.2/Lenti 表達載體為鄭州大學微生物學與免疫學教研室保存。RPMI 1640 培養液購自美國Gibco 公司。ViraPowerTM慢病毒包裝混合物(經優化的包含3 種包裝質粒的混合物)、轉染試劑LipofectamineTM2000 購自美國Invitrogen 公司。膠回收試劑盒及小量質粒提取試劑盒購自Axygen 公司。兔抗人GST-π 抗體、羊抗兔多克隆抗體及TRITC 標記的羊抗兔抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司。編碼發卡樣RNA 的寡核苷酸及相關引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 siRNA 的設計與合成根據 GenBank BT019950 GST-π mRNA 序列，應用Ambion siRNA靶序列分析設計系統，針對靶基因序列設計多個RNA 干擾(RNAi)靶點序列，最終確定2 個長為19 bp 的靶序列:5'-GACCTCCGCTGCAAATACA-3'(295～313 位點)、5'-GAGGCAAGACCTTCATTGT-3'(416～434 位點)。設計分別針對這2 個靶序列的2對編碼短發卡RNA 的寡核苷酸序列(第一對為GST11、GST12;第二對為GST21、GST22)，同時依據這2 個靶位點的堿基組成，隨機組合出一條無關對照寡核苷酸序列5'-TACGCTGACTTGATTGTTC-3'，針對該序列的編碼短發卡RNA 的寡核苷酸序列為GSTC1、GSTC2。

1.3 siRNA 慢病毒表達載體的制備與鑒定 用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切pRNAT-U6.2/Lenti 載體，與設計合成的GST-π siRNA 模板寡核苷酸膠回收產物連接后轉化到DH5α 感受態細菌中，陽性克隆送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。成功得到3 種siRNA 慢病毒表達載體:pRNAT-U6.2/LentisiGST1、pRNAT-U6.2/Lenti-siGST2、pRNAT-U6.2/Lenti-siGSTC。

1.4 慢病毒包裝 將ViraPowerTM慢病毒包裝混合物和siRNA 慢病毒表達載體(pRNAT-U 6.2/LentisiGST1、pRNAT-U6.2/Lenti-siGST2 或pRNAT-U6.2/Lenti-siGSTC)轉染至293FT 細胞，置CO2培養箱，37℃孵育過夜后更換為含1 mol/L 丙酮酸鈉的完全培養基培養。轉染48～72 h 后將含病毒的上清液移至15 mL 無菌錐形管，4℃3 000 r/min 離心5 min，除去細胞碎片。210 000 g 離心90 min，棄上清，450 μL PBS 重懸。3 種病毒分別命名為GSTsi1、GSTsi2 和GSTsiC。吸取病毒懸液至冷凍管分裝，－80℃保存。

1.5 病毒滴度測定 將293FT 細胞按2×105個/孔接種至6 孔板中，24 h 后取病毒GSTsi1、GSTsi2和GSTsiC 懸液作不同比例稀釋(1 ∶103～1∶1010)，按每孔400 μL 加至細胞培養板中，37℃培養4～6 h。換新鮮培養基，繼續培養24 h，熒光顯微鏡下觀察，病毒滴度參照文獻［9］的方法計算。

1.6 免疫熒光實驗 EC9706/cDDP 細胞接種24 h后，按細胞與病毒數1∶10 的比例加入GSTsi2 病毒稀釋液，將細胞用40 g/L 多聚甲醛固定、體積分數為20%正常山羊血清封閉后，加一抗(兔抗人GSTπ 抗體)4℃孵育過夜，PBS 沖洗3 次后加二抗(TRITC 標記的羊抗兔抗體)。暗環境37℃條件下孵育2 h，沖洗后用水溶性封片劑封片。

1.7 GST-π mRNA 和蛋白表達的檢測 分別用相關基因引物進行半定量RT-PCR，以β-actin 作內參。PCR 反應體系含:10× Buffer 3.0 μL，Taq 酶0.15 μL，dNTP 2.4 μL，上、下游引物各1.0 μL，模板2.0 μL。PCR 反應條件:94℃5 min 預變性;94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸60 s，35 個循環;72℃延伸5 min。GST-π mRNA 的相對表達量以目的基因與內參條帶灰度值的比值表示。Western blot法檢測GST-π 蛋白的表達。取50 μg 蛋白樣品進行SDS-PAGE 電泳，電泳后利用電印記法將凝膠中的蛋白質轉移到PVDF 膜上。將含50 g/L 脫脂奶粉且TBS 封閉后的PVDF 膜置于封閉液稀釋的兔抗人GST-π 一抗中，室溫搖床振蕩1 h，取出漂洗;再加入用封閉液稀釋的羊抗兔多克隆抗體中，室溫搖床振蕩1 h，取出漂洗。用ECL 試劑化學發光、顯影。

1.8 MTT 法檢測細胞對順鉑耐藥敏感性的變化取GSTsi2、GSTsiC 感染和未感染的EC9706/cDDP對數生長期細胞，以3×104mL－1細胞濃度接種于96 孔培養板，200 μL/孔。24 h 后更換含不同終濃度順鉑的培養液，每一濃度重復4 孔，并設不含藥的空白對照孔。48 h 后加入5 g/L MTT 20 μL/孔，繼續培養4 h 后，加入二甲基亞砜(DMSO)200 μL/孔，充分混勻，以波長550 nm 測各孔吸光度(A)值。同時檢測親本EC9706 細胞。增殖抑制率=(1 －加藥孔A 值/對照孔A 值)×100%。計算IC50。耐藥指數(RI)=實驗細胞IC50/親本細胞IC50。

1.9 統計學處理 采用SPSS 17.0 軟件對數據進行處理分析。各組細胞GST-π mRNA 表達和RI 差異的比較采用單因素方差分析及SNK-q 檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 siRNA 慢病毒表達載體的鑒定結果 重組質粒的PCR 鑒定結果見圖1。陽性克隆測序結果與設計序列完全一致。

圖1 重組質粒的PCR 鑒定結果

2.2 病毒滴度的測定結果 經測定，GSTsi1、GSTsi2 和GSTsiC 的病毒滴度均可用于后續的細胞感染。病毒感染EC9706/cDDP 細胞48 h 后在熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白的表達，隨時間的延長表達增強。細胞的感染率較高，幾乎所有細胞均被感染。慢病毒感染過的細胞上清液收集后用于新的EC9706/cDDP 細胞培養，48 h 后未見有熒光，表明慢病毒感染細胞后的上清沒有感染性，安全性較高。

2.3 各組細胞中GST-π mRNA 和蛋白表達的比較 見表1、圖2。

表1 各組細胞中GST-π mRNA 的表達(n=4)

圖2 各組細胞中GST-π蛋白的表達

2.4 各組細胞對順鉑耐藥敏感性的變化 見表2。

表2 各組細胞的RI 比較(n=4)

2.5 免疫熒光實驗結果 免疫熒光實驗結果見圖3。GSTsi2 干擾后在熒光顯微鏡下發紅色熒光的EC9706/cDPP 細胞數目少且熒光很弱，表明GSTsi2可有效抑制細胞內GST-π 基因的表達。

圖3 免疫熒光實驗結果(×100)

3 討論

GST 廣泛分布于人的正常組織，與惡性腫瘤的關系密切，是腫瘤細胞耐藥的標志之一。Tew 等［9］對于腫瘤細胞株的研究發現，GST-π 參與了細胞對順鉑、阿霉素以及絲裂霉素C 耐藥的產生。張帆等［10］發現術前未經治療的卵巢癌在一定程度上存在著由GST-π 介導的內在性的耐藥機制，GST-π 的表達能較好地預測化療反應。

近年來對MDR 逆轉的研究有較大進展。隨著科研人員對GST 的結構和生物學功能的深入研究，一些以GST 為靶點的腫瘤MDR 逆轉劑被發現。Yu等［11］的研究表明色胺酮可以抑制MCF-7 細胞株的GST 活性并且降低GST-π 的表達。在已有的逆轉MDR 的反義基因治療技術中，常用的是反義寡核苷酸和核酶，它們特異性地作用于MDR 基因，使其轉錄和翻譯過程受阻，從而達到逆轉MDR 的目的。Ban 等［12］發現針對GST-π 基因的反義cDNA 轉染能夠引起腫瘤細胞對包括順鉑、阿霉素在內的多種抗腫瘤藥物的敏感性增強。RNAi 是dsRNA 介導的轉錄后基因沉默，具有高效性、高度特異性和可遺傳性，是一種新興的基因治療技術。以特異性短發卡RNA 介導的RNAi 技術為逆轉腫瘤細胞MDR 的治療開創了新的思路［13-16］。應用siRNA 克服食管癌治療中對順鉑的耐藥，不僅將提高腫瘤的化療效果，減少化療藥物的用量，降低化療藥物的毒副作用，而且對克服其他腫瘤中的MDR 現象也有借鑒意義。

課題組前期研究提示 GST-π 很可能在EC9706/cDDP MDR 的形成中起一定作用(待發表)。為了明確GST-π 基因沉默是否會在一定程度上逆轉腫瘤細胞的耐藥性，該實驗用靶向GST-π 的siRNA 重組慢病毒GSTsi1、GSTsi2 感染EC9706/cDDP。結果顯示RNAi 策略可下調EC9706/cDDP 細胞GST-π mRNA 的相對表達水平，GST-π 蛋白表達也減弱。作者選擇干擾能力更強的GSTsi2 感染EC9706/cDDP 細胞，結果顯示該細胞對順鉑的RI下降。以上結果表明GST-π 的表達與腫瘤細胞的耐藥性相關，RNAi 技術可逆轉腫瘤細胞的耐藥性，這為應用siRNA 逆轉腫瘤耐藥提供了可行依據，并為尋找有效的食管癌臨床化療方案提供了參考。

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